多肉植物姬秋丽组培快繁技术研究

王德信 石浩 王少祥 罗伟沼 魏玉键 李浩 杨晓莹 梁宏玲

【摘要】以姬秋丽的叶片和茎尖为外植体材料，进行多肉植物组培快繁技术研究。研究结果表明：以茎尖为外植体培养效果最佳，先用75%乙醇处理30s，再用0.1%升汞浸泡12 - 15min为最佳消毒处理方法;以MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA、NAA、KT等植物生长调节剂，适宜诱导姬秋丽愈伤组织及丛生芽的培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.Omg/L，效果明显;丛生芽增殖培养基MS+6-BA 2mg/L+KT l.Omg/L+NAA 0.2mg/L最为适宜;生根培养基以1/2MS+IBA 2.0mg/L为最佳，试验证明最终成苗率可达90%以上，根部粗壮生长状态良好，研究表明姬秋丽组织培养快繁技术体系增殖数高，易成活，质量高。

【关键词】姬秋丽;组织培养;快繁体系

【中图分类号】S682.33

【文献标识码】A

姬秋丽（ Graptopetalum mendazoe）是景天科风车草属多肉植物，姬秋丽是一种杂交的品种，名字是由日本传过来的。姬秋丽为迷你型多肉植株，植株丛生，多分枝，呈莲座叶盘状。叶子椭圆形，叶片较小，一般小于2cm，叶上分布着或多或少的细微红点。单株直径3cm左右，叶子颜色呈绿色或黄绿色，但强光环境下呈红色或橘红色，姬秋丽春季开花，花小巧玲珑。枝茎比较短，看上去比较紧凑。

姬秋丽具有非常高的观赏价值，是近几年在国内多肉市场流行的品种之一，但是姬秋丽生产主要由叶插繁殖并且繁殖速度慢，生产周期慢，而且病毒不断积累，进而影响品质，严重影响姬秋丽的口碑。本研究主要通过对6-BA、NAA、KT、IBA等植物生长调节剂适合浓度筛选探索姬秋丽丛生芽诱导、增殖、生根繁殖等关键环节的影响因素，利用组织培养技术快速繁殖生产多肉植物，提高多肉植物的品质和产量，增加收入。本研究通过对多肉植物姬秋丽组织培养体系的探索，为姬秋丽快速繁殖提供组培技术，同时加快姬秋丽的工厂化生产进程。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

以生长状况良好的姬秋丽为研究材料，选取生长状况良好的叶片和茎尖为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理。（1）将姬秋丽叶片用自来水冲洗干净，用纱布分别将姬秋丽叶片和茎尖包裹住，将纱布绑定在水龙头上，固定好，打开水龙头冲洗20 - 30min，调整位置保证冲洗均匀。

（2）冲洗完后，从水龙头取下纱布，取准备好的表面洗涤剂（洗衣粉或者洗洁精）适量放入lOOOml烧杯中，加自来水用玻璃棒搅拌混匀，混匀后将纱布中的姬秋丽叶片和茎尖轻轻放人烧杯。玻璃棒搅拌后，静置30min充分去污。

（3）取出姬秋丽叶片和茎尖，用纱布清洗叶片和茎尖表面，清洗的过程中一定要全面，细细轻柔搓洗，洗净之后再用自来水冲洗姬秋丽叶片和茎尖20 - 30min。

（4）取出外植体材料用75%的酒精浸泡30 - 60s。

（5）倒人0.1%的升汞（HgC12）浸泡10 - 15min。

（6）无菌水冲洗4-5次。

1.2.2无菌室及超净台灭菌。先对无菌室进行灭菌，然后用酒精棉球擦拭超净台，打开超净台紫外线灯，预先20min，杀菌消毒，打开排气扇，防止细菌进入，保持一个无菌的环境。

1.2.3 无菌操作。将处理的姬秋丽叶片、茎和茎尖放人超净工作台内，先用浓度为75%的酒精灭菌30 - 60s，要轻微震荡切勿摇出。再用无菌水冲洗2-3次，每次10s - 20s，然后用0.1%升汞（ HgC12）渗透内部灭菌，轻轻摇晃10in，最后用无菌水冲洗3-5次。灭菌后的叶片切成0.5cm×0.5cm的方块，茎和茎尖切成0.5cm茎段，分别接种于预先灭菌的培养基上培养。

1.3 培养条件

试验在NLS基本培养基基础上添加6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值调节至5.8 - 6.0，121℃高压灭菌锅中灭菌20min，常温后添加激素（激素已抽滤灭菌）备用。培养室温度控制在25℃，光照强度20001x，光周期为16h光照，6h黑暗。

1.4诱导培养

在MS基本培养基基础上分别添加不同浓度的6-BA、NAA和KT激素，设置三种激素水平（见表1），利用不同外植体和最合适灭菌方法，将外植体接种于各种培养基上，采用L。（ 34）正交试验设计（见表2），每种处理接种5瓶，每瓶接种4个外植体，3次生物学重复，30 - 45d统计诱导情况。

1.5 增殖培养

在MS基本培养基基础上分别添加不同浓度的6-BA、NAA和KT激素，设置不同激素水平（见表3），将初代培养中诱导得到的丛生芽或愈伤组织接种于以MS为基本培养基，分别附加不同含量NAA、6- BA、KT的培养基中进行增殖培养，采用k（ 34）正交试验设计（见表4），每个处理5瓶，每瓶接种1株，重复3次，30d后统计增殖情况。

1.6生根培养与移栽

无菌条件下，将增殖后的丛生芽分离出单芽，分别接种于生根培养基上进行生根培养，生根培养基以1/2MS作为基本培养基，在此基础上添加不同浓度的IBA（1、2、3mg/L），同时添加15g/L的活性炭，培养30d后统计组培苗的成长情况。当植株长至约4cm时进行炼苗移裁，以泥炭、蛭石、珍珠岩复配材料为炼苗基质，按照3：1：1比例混匀，121℃高压蒸汽灭菌消毒后使用。打开瓶口炼苗，10d后用镊子将小苗取出，清除附着在根部的培养基，移栽于基质中，30d后统计组培苗的生长情况。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌条件的筛选

试验中分别用75%酒精、2%次氯酸钠及0.1%升汞分别对姬秋丽多肉植物的不同外植体进行灭菌时间条件摸索（见表5），结果表明：利用75%酒精和2%次氯酸钠灭菌材料，无论是叶片还是茎，污染率较高，最高的可以达到96.3%，最低污染率67%。说明Naao不适合多肉植物姬秋丽外植体的的灭菌。然而利用75%酒精和1%升汞灭菌材料，污染率较低，最低的仅有6.7%，说明多肉植物组培中，外植体灭菌选用75%酒精和o.1%升汞灭菌最为适合;研究还表明随着HgC12灭菌时间延长，污染率逐步下降，使用HgCI2對最外植体表面进行消毒，灭菌效果更好。叶片消毒时间不宜过长，一般不超过15min为宜，时间过长，会导致后续培养生长缓慢，时间太短，污染率偏高。

2.2 愈伤组织及丛生芽分化诱导分析

不同激素配比的培养基均能成功诱导姬秋丽形成愈伤组织（见表6），诱导率最高可达到85%，大多数能够诱导分化出丛生芽，少部分愈伤组织继代培养之后褐化死亡。以姬秋丽的叶为外植体，当培养基为MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）时，诱导形成丛生芽的诱导率为76.7%，愈伤组织结构紧密，呈淡黄绿色，丛生芽数量多，整齐度高。研究结果表明适宜诱导姬秋丽愈伤组织及丛生芽的培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

2.3 不同激素浓度配比对丛生芽增殖的影响

通过诱导长出丛生芽之后就转接到增殖培养基上进行增殖培养，丛生芽增殖结果见表7。结果表明，丛生芽增殖培养的9种激素配比培养基均有较理想的增殖效果，增殖系数集中在5-9之间，随着6-BA浓度增加，增殖效果也稍好。其中MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 1.0 mg/L取得最佳增殖培养效果，在培养30d以后，大部分丛生芽的基部均可连续分化出5 - 10个单芽，经过45d之后，即可呈现出团簇状丛生，而后丛生芽逐渐变为深绿色。

2.4 不同IBA浓度对生根的影响

待姬秋丽无菌培养长出增殖丛生芽之后，分离出单芽转移到生根培养基上，在1/2MS基本培养基基础上添加3种不同浓度的IBA及1.5g/L的活性炭，结果表明：1/2MS+IBA 2.0mg/L+活性炭1.5g/L的培养条件最为适宜，生根数量多，效果好，IBA植物生长调节剂对于姬秋丽生根诱导有促进作用。

3 讨论

多肉植物繁殖速度慢，利用组培快繁技术能够快速获得大量组培苗。多肉植物由于肉质多汁液，外植体的消毒需要彻底，否则污染率较高，本实验结果中利用洗衣粉浸泡30min后用75%乙醇和0.1%升汞配合消毒技术，取得较好结果，污染率控制在7%左右。在虹之玉、姬胧月、玉露、佛手等多种多肉植物外植体灭菌中进行了尝试，均取得了良好的效果，证明该方法非常有效。

外植体选择上，发现茎尖诱导率明显高于茎和叶片，而且多数茎尖诱导不经过愈伤组织即可生长出芽和苗，成苗率好，相对叶片和茎诱导率高，有的叶片诱导愈伤組织时能够很快诱导生根。

本系统中筛选出来的愈伤组织及丛生芽诱导培养基，在虹之玉、姬胧月、玉露、佛手等多肉植物快繁中进行试验，发现在虹之玉和姬胧月组培中取得较好效果，但是需要培养基中的激素浓度微调，玉露、佛手等多肉植物中效果不理想，说明不同多肉植物组培条件不完全一致，需要根据多肉植物自身特点，采用不同增殖方法。本研究初步建立了姬秋丽等多肉植物的组织培养的最佳外植体及各培养阶段的最佳培养基配方，结果表明愈伤组织具有高诱导率及成苗率，为姬秋丽的工厂化育苗提供了技术支撑。

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[作者简介]王德信（1975-），男，山东聊城人，博士，副教授，研究方向：组织培养技术，植物基因表达调控及功能。