H9N2亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立

李云燕，谢芝勋，李 孟， 罗思思，谢丽基，张民秀，黄娇玲，谢志勤，邓显文，范 晴，曾婷婷，王 盛

(1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001)

禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科，A型流感病毒属[1-2]。A型AIV根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的不同，分为16种HA亚型和9种 NA亚型，但近年第10种NA 亚型和第17，18种HA亚型已经在蝙蝠中被发现[3]。我国于1992年广东省首次报告H9N2亚型禽流感疫情，随后，H9N2亚型禽流感蔓延到全国绝大多数养殖地区。近年来，病毒的遗传变异及致病性不断发生变化，目前，H9N2亚型AIV已成为严重威胁家禽业健康发展的优势基因组合[4]。此外，H9N2亚型AIV已被证明对公共卫生具有重要意义，不仅能直接感染人类[5-6]，还能为新的H6N1、H7N9、H10N8和H5N6亚型等感染人重组病毒提供部分甚至全部的内部基因。由此可见，H9N2亚型AIV无论是对家禽产业还是人类的公共卫生安全都存在巨大威胁[7-10]。

目前AIV的检测方法主要有病毒分离鉴定及荧光RT-PCR等，但是病毒分离鉴定耗费时间长且结果受标准阳性血清反应原性的影响较大，荧光RT-PCR需要昂贵的仪器设备且成本高。环介导等温扩增检测技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)需要特殊设计的内引物和外引物共6条引物，6条引物同时扩增；因此LAMP方法不仅扩增效率高，而且特异性好。目前LAMP技术已经广泛应用于各种病原检测[11]，但是已有的二重LAMP检测技术还有一定的局限性，在不进行凝胶电泳的情况下很难辨别扩增产物。本试验的目的是为了建立一种操作简单，反应快速，特异性高且肉眼能直观迅速判断结果的H9N2亚型AIV检测方法，为临床检测提供快速灵敏且准确的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 毒株H1N1、 H3N2、 H4N6、H6N5、H6N6、H9N2 和H9N8亚型AIV以及新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)由本实验室分离保存；H2N2、H5N9、H7N7和H11N9 cDNA模板均由美国宾夕法尼亚大学惠赠；H8N4、H10N3、H12N5、H13N5、H14N、H15N9和 H16N3 cDNA 模板均由美国康涅狄格州大学惠赠。

1.2 主要仪器与试剂RNA抽提试剂盒、pEASY-T载体和胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术公司;SPF鸡胚购自北京梅里亚公司;反转录试剂盒和质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)公司;LAMP DNA扩增试剂盒购自荣研生物科技(中国)有限公司;Loopamp LA-320C 实时浊度仪购自日本荣研化学株式会社;多色荧光成像仪购自美国BIO-RAD公司;核酸浓度测定仪购自美国ThermoFisher Scientific 公司。

1.3 引物设计参照GenBank登录的H9N2亚型AIV的HA、NA基因序列，利用Lasergene软件进行序列的比较与分析，用Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/)在线软件设计2套LAMP引物，每套含有6条引物包括1对外引物F3、B3和1对内引物FIP(F1c +F2)、BIP(B1c+B2)，在引物F1c和B1C之间设计探针。引物序列见表1。

表1 RT-LAMP引物信息

1.4 RNA抽提根据RNA抽提试剂盒说明书步骤抽提病毒RNA，再根据反转录试剂盒操作说明将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

1.5 标准品的制备用表1中 HA和NA引物组中的F3和B3引物分别扩增HA、NA基因，将胶回收产物连接入pEASY-T载体，挑选鉴定为阳性克隆菌送测序公司进行测序。挑选测序结果正确的目标菌扩大培养后提取质粒，-20℃ 保存质粒DNA备用。

1.6 反应体系的优化参照文献[12-14]方法，确定LAMP反应条件的优化过程包括反应温度、dNTPMix及MgSO42种试剂的终浓度和探针的终浓度。本试验温度的优化按60，61，62，63，64，65℃依次递增反应80 min，80℃作用5 min。2种反应试剂的终浓度按照dNTPMix(0.4～1.6 mmol/L)和MgSO4(2～10 mmol/L)优化，探针的终浓度按照 0.02～0.05 μmol/L优化。

1.7 特异性试验按照本方法检测HA基因的16种亚型(H1～H16)和NA基因的9种亚型(N1～N9)以及NDV、IBV和ILTV，观察反应结果是否只在含有H9和N2亚型AIV的反应试管有扩增产物，并产生相应的荧光，验证本方法的特异性。

1.8 干扰性试验为了验证在本方法中高浓度模板是否会抑制低浓度模板的扩增，将HA和NA模板标准品浓度按照一高一低进行组合：组合1 HA+NA(107拷贝/μL+102拷贝/μL)，组合2 HA+NA(106拷贝/μL+103拷贝/μL)，组合3 HA+NA(102拷贝/μL+107拷贝/μL)，组合4 HA+NA(103拷贝/μL+106拷贝/μL)，用RT-LAMP方法进行检测验证。

1.9 敏感性试验将上述保存的HA和NA质粒，等浓度混合，进行10倍梯度稀释，取106～100拷贝/μL 7个稀释梯度，按照优化好的体系进行检测，同时用实时浊度仪检测所建立方法的敏感性。

1.10 临床样品检测从南宁地区随机选取5个活禽市场采集180份鸡、鸭和鹅咽喉及泄殖腔棉拭子，用本试验所建立的二重RT-LAMP检测方法进行检测，同时将相同编号剩余的样品接种于SPF鸡胚进行AIV的分离与鉴定，并将鉴定结果为H9N2亚型AIV的阳性样品进行HA基因的序列测定。然后将上述2种方法的结果进行比较，进而验证二重RT-LAMP检测结果的准确性。

2 结果

2.1 反应体系的确定25 μL LAMP反应体系：3.5 μL dNTPs(终浓度为1.4 mmol/L)、2.5 μL 10×Bst Buffer、1 μL Bst DNA聚合酶8 U(终浓度为320 U/L)、2 μL MgSO4(终浓度为8 mmol/L)、2 μL 引物预混液 (终浓度为FIP 1.6 μmol/L、 BIP 1.6 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、F3 0.2 μmol/L)、1 μL探针预混液(终浓度各为 0.02 μmol/L)、2 μL混合质粒(HA+NA)模板，加水至25 μL，在62℃恒温条件下反应80 min。

2.2 检测结果使用多色荧光成像系统观察反应结果，在520 nm通道下被标记FAM荧光基团的HA探针可见绿色荧光，在670 nm通道下被标记有CY5.5荧光基团的NA探针在阳性反应管中可见红色荧光；所以在双通道下若观察到反应试管呈红色荧光则说明N2亚型AIV阳性，若观察到反应管呈绿色荧光则说明H9亚型AIV阳性；反应管呈黄色荧光(红色和绿色混合所呈现的颜色)则说明H9N2亚型AIV阳性。

2.3 特异性试验根据在双通道观察的结果(图1)可知：第2，3号反应试管检测结果呈红色荧光，说明N2亚型AIV检测结果阳性，同时第2，3号试管检测模板是H2N2和H3N2亚型AIV，检测结果与模板信息一致；第10号反应管呈绿色荧光说明H9亚型AIV检测结果阳性，同时第10号反应试管检测模板是H9N8亚型AIV，检测结果与模板信息一致；第11号试管呈黄色荧光，说明H9N2亚型AIV检测结果阳性，同时第11号反应试管检测模板是H9N2亚型AIV，检测结果与模板信息一致；其余反应试管没有观察到荧光，说明不含有H9或者N2任意一种亚型AIV，与检测模板信息一致。由此可见本试验建立的方法特异性高，只会对HA基因的H9亚型和NA基因的N2亚型进行扩增，不会对HA基因的其他15种亚型和NA基因的其余8种亚型进行扩增，也不会对NDV、IBV和ILTV这些禽类常见病原体进行扩增。

图1 特异性试验在多色荧光成像系统双通道下的观察结果 1.H1N1；2.H2N2；3.H3N2；4.H4N6；5.H5N9；6.H6N5；7.H6N6；8.H7N7；9.H8N4；10.H9N8；11.H9N2；12.H10N3；13.H11N9；14.H12N5；15.H13N5；16.H14N5；17.H15N9；18.H16N3；19.NDV；20.IBV；21.ILTV；22.阴性对照

2.4 干扰性试验使用多色荧光成像系统分别在520，670 nm单通道下观察(图2A、B)可以看出4个反应管内红色和绿色荧光亮度都强，说明高浓度的模板并没有抑制低浓度模板的扩增。在520，670 nm 双通道下观察反应结果呈黄色荧光(图2C)，说明在不同模板浓度的组合下H9和N2亚型AIV都进行了有效扩增，不同浓度模板相互之间不存在干扰。

图2 干扰性试验在多色荧光成像系统下的观察结果 A.520 nm通道;B.670 nm通道;C.520，670 nm双通道。1.HA+NA(107拷贝/μL+102拷贝/μL)；2.HA+NA(106拷贝/μL+103拷贝/μL)；3.HA+NA(102拷贝/μL+107拷贝/μL)；4.HA+NA(103拷贝/μL+106拷贝/μL);5.阴性对照

2.5 敏感性试验由实时浊度仪生成的速率曲线可知(图3)，本方法的最低检测限度为100拷贝/μL，总耗时80 min。图4是在多色荧光成像系统下观察的结果，图4A是在520 nm 通道下观察的试验结果，反应结果呈绿色荧光，说明H9亚型AIV阳性；图4B 是在670 nm 通道下观察的试验结果，反应结果呈红色荧光，说明N2亚型AIV阳性；图4C是在520,670 nm 双通道下观察结果，呈黄色荧光，这是由红色荧光和绿色荧光混合而呈现的颜色，说明样品是H9N2亚型AIV。实时浊度仪敏感性监测结果与肉眼观察颜色变化结果是一致的，同时与质粒模板实际模拟结果也是相符合的。

图3 RT-LAMP敏感性试验实时浊度仪检测结果 1～5.混合质粒浓度106～102拷贝/μL；6～7.混合质粒浓度10，1拷贝/μL；8.阴性对照

图4 敏感性试验在多色荧光成像系统下的观察结果 A.520 nm 通道;B.670 nm 通道;C.520，670 nm 双通道。1～5.混合质粒浓度106～102拷贝/μL；6～7.混合质粒浓度10，1拷贝/μL；8.阴性对照

2.6 临床样品检测结果从活禽市场采集180份鸡、鸭和鹅咽喉及泄殖腔棉拭子，运用本试验所建立的二重RT-LAMP检测方法进行检测，结果显示有19份样品为H9N2亚型AIV阳性。将相同样品接种于SPF鸡胚进行AIV的分离与鉴定，结果显示有20份H9N2亚型AIV阳性。将上述2种方法的结果进行比较，结果表明，二重RT-LAMP检测结果与AIV的分离与鉴定方法检测结果符合率为95%。

3 讨论

LAMP方法依靠具有链置换活性的Bst-DNA聚合酶和一组特殊设计的内、外引物在60～65℃恒温条件下进行自循环链置换DNA合成。在LAMP反应的初始阶段，内外引物均被使用，形成哑铃状的DNA扩增产物，在随后的循环反应中，只有内引物被用于链置换DNA的合成。15～60 min即可进行核酸扩增，效率可达109～10m个数量级，具有操作简单、特异性强和产物易检测等特点。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，在基层有着广泛的应用前景。

目前LAMP扩增产物分析的方法主要有：观察2%琼脂糖凝胶电泳结果，看是否产生梯形条带；开盖加入荧光染料SYBR Green 观察颜色变化，这2种方法共同的缺点是需要开盖，开盖会导致气溶胶污染实验室，从而导致下一次观察时产生假阳性结果；反应前预先加入钙黄绿素观察反应前后的颜色变化[15]，这种方法虽然不用打开反应试管盖，但是不适用于二重LAMP结果的观察。FAN等[16]在2018 年建立了二重荧光LAMP，该方法是在2种病毒的FIP引物上标记不同的荧光基团，使用多色荧光成像系统观察凝胶电泳结果，通过荧光颜色分析判断产物类型，该方法实现了二重LAMP鉴别诊断，但是依然需要打开反应试管盖。

本试验所建立的二重RT-LAMP检测方法除了设计HA-H9N2和NA-H9N2这2套LAMP引物之外，在2套引物的F1c和B1c之间又各设计了1条探针引物，在HA探针的5′端标记FAM荧光基团，在NA探针的5′端标记Cy5.5荧光基团，2条探针的3′端均标记BHQ2猝灭基团；在反应过程中探针被酶切降解，荧光基团和猝灭基团因此分离，从而产生1个游离的荧光基团，即每扩增1条DNA链，就有1个游离的荧光基团产生[17]；由于LAMP反应可以在短时间内扩增出大量的DNA产物，所以就会产生大量的游离荧光基团。本试验使用多色荧光成像系统观察反应结果，在520 nm通道下被标记FAM荧光基团的HA探针阳性结果反应管中可见绿色荧光，在670 nm通道下被标记有Cy5.5荧光基团的NA探针在阳性反应管中可见红色荧光。因此在双通道下观察，当反应管中可见绿色荧光时说明H9亚型AIV阳性，当反应管中可见红色荧光说明N2亚型AIV阳性，如果反应管中可见黄色荧光时，说明2个通道均呈阳性，样品中有H9N2亚型AIV。本试验检测方法的建立吸收了 FAN等[12]使用不同荧光基团区分病毒的思路，同时对其方法加以改进，既能实现在同一反应中扩增并鉴别2种病毒，又无需开盖进行凝胶电泳，或者添加染料，避免了交叉污染。本试验成功建立了二重RT-LAMP方法检测H9N2亚型AIV，该方法灵敏、快速、特性高以及扩增产物肉眼容易直接区分鉴别，可为临床快速检测鉴定H9N2亚型AIV毒株提供很好的技术支撑。