牛诺如病毒、牛星状病毒和牛环曲病毒多重PCR检测方法的建立及应用

师志海，徐照学，兰亚莉，张 彬，孟红丽，王亚州，金 磊，王文佳

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002；3.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

犊牛腹泻(calf diarrhea，CD)是临床中常见的一种综合征，给全球养牛业带来巨大的经济损失[1]，严重影响犊牛早期的生长发育和后期生产性能的发挥。同时，因其死亡率高，亦严重影响牛群的更新和养牛业的良性发展。CD病因复杂，其中病毒感染是引起腹泻的重要原因[2]。据报道，除了牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus，BRoV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)等常见的可以导致CD的病毒外，牛诺如病毒(bovine norovirus，BNoV)、牛星状病毒(bovine astrovirus，BAstV)和牛环曲病毒(bovine torovirus，BToV)等新发病毒在CD病原谱中也越来越备受关注[2-3]。特别是近年来，这3种病毒在我国CD粪便样本中均被检测到[4-5]。因此，进一步加强对BNoV、BAstV和BToV的检测将对CD的防控具有重要意义。

BNoV是杯状病毒科、诺如病毒属的无囊膜单股正链RNA病毒。BNoV是国内CD的新发病原，国内流行的BNoV毒株具有丰富的遗传多样性，包括GⅢ.1和GⅢ.2型[4]。BAstV属于星状病毒科、哺乳动物星状病毒属的单股正链RNA病毒，全长6.0～6.5 kb。目前已发现BAstV有肠道型和神经型2种，且二者基因组在结构上有明显差异[6]，在国内尚未发现神经型BAstV。BToV属于冠状病毒科环曲病毒属，为单股正链RNA，大小为25～30 kb。首次于1979年在美国腹泻犊牛的粪便样品中分离得到，命名为布里达病毒(Breda virus)，即牛环曲病毒[7]。而后BToV陆续报道在多个国家牛群中被检出[8-10]，全球范围内从腹泻犊牛粪便中BToV的检出率为2.9%～36.4%[10-11]。

双重及多重PCR检测方法主要用于鉴定一些病原微生物以及同时检测多种病原体，在临床检测中多重PCR检测方法具有高效性、系统性和经济简便性等特点。目前未见BNoV、BAstV和BToV多重PCR检测方法的报道。基于此，本试验建立BNoV、BAstV和BToV多重PCR检测方法，并在河南省规模化牛场采集样品进行检测，以期为BNoV、BAstV和BToV的疫情监控、临床检测、综合防控及分子流行病学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料2017年9月至2019年5月，221份腹泻犊牛粪便样本采集自河南规模化牛场，全部样品单独分装，详细记录品种、年龄、采样日期、样品数量等信息。BNoV、BAstV、BToV、BCoV、BRoV、BVDV、牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)、牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV)阳性样品均由本实验室鉴定保存。

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(9766)，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)，克隆载体pMD18-T(6011)，大肠杆菌JM109感受态细胞(9052)，2×Premix Taq(R004A)，DL2000 DNA Marker(3427A)等均为TaKaRa公司产品；胶回收试剂盒Gel Extraction Kit(D2500)和质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(D6943)为OMEGA公司产品。

1.2 核酸提取221份粪便样品，用PBS 按1∶10混悬，漩涡振荡，4℃ 8 000 r/min离心5 min，取上清，-80℃保存备用。病毒RNA的提取参照提取试剂盒，-80℃保存病毒RNA；cDNA的反转录参照逆转录试剂盒，-20℃保存。

1.3 引物设计与合成利用Oligo 6.0软件，参照GenBank基因序列，选取BNoV的RdRp、BAstV的ORF1a和BToV的S基因保守区域分别设计1对引物，预计扩增BNoV、BAstV和BToV的片段大小分别为542，376和698 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.4 目的片段的扩增及标准品的制备BNoV、BAstV及BToV的单一RT-PCR反应体系：2×Premix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，cDNA模板1 μL,ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 3 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收扩增产物，分别与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18-T-BNoV、pMD18-T-BAstV和pMD18-T-BToV，将质粒测序，验证序列的准确性。用超微量核酸蛋白分析仪测定阳性质粒的浓度，计算模板质粒的拷贝数。

1.5 PCR扩增对多重PCR反应的引物、模板等用量进行优化和多次重复试验后确定最佳反应体系。将反应退火温度从45～56℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。每次设置阴性对照。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

1.6 特异性试验用建立的多重PCR方法对BNoV、BAstV、BToV、BCoV、BKoV、BRoV、 BVDV和BNeV进行检测，并以ddH2O为阴性对照，验证该方法的特异性。

1.7 敏感性试验将pMD18-T-BNoV、pMD18-T-BAstV和pMD18-T-BToV分别进行10倍梯度稀释，用本试验建立的RT-PCR方法进行检测，找出质粒的最低检测限。

1.8 重复性试验以构建的阳性质粒为模板，用本试验建立的多重PCR方法每隔1周重复检测1次，连续检测3次，以确定方法的可靠性和重复性。

1.9 应用性试验用所建立的多重PCR方法对221份临床腹泻粪便样本进行检测，并与单一PCR检测结果进行比较。

2 结果

2.1 多重PCR体系的构建及优化通过对退火温度及引物浓度等条件的优化，最终确定该多重PCR体系：2×Premix Taq 10 μL，上、下游引物各0.1 μL (10 μmol/L)，质粒模板各0.2 μL，ddH2O补足20 μL。最佳退火温度为54℃，最佳反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 7 min。多重PCR扩增出BNoV、BAstV及BToV的目的片段约为550，400和700 bp(图1)，与预期相符。所有扩增出的特异性目的片段均经过测序验证。

图1 BNoV、BAstV和BToV多重和单一PCR扩增结果 M.DL2000 DNA Marker；1.多重PCR扩增产物；2～4.分别为BAstV、BNoV、BToV单一PCR产物；5.阴性对照

2.2 特异性试验用建立的多重PCR方法检测不同的阳性样品，结果表明，仅BNoV、BAstV和 BToV能扩增出特异性条带，与目的片段大小一致，其他病毒均未扩增出条带；说明本试验建立的多重PCR方法具有良好的特异性(图2)。

图2 多重PCR的特异性试验 M.DL2000 DNA Marker；1.BNoV、BAstV和BToV多重PCR扩增产物；2～9.分别为BAstV、BNoV、BToV、BRoV、BCoV、BVDV、BKoV和BNeV的PCR产物；10.阴性对照

2.3 敏感性试验经核酸分析仪测定，pMD18-T-BNoV、pMD18-T-BAstV和pMD18-T-BToV的质粒质量浓度分别为47.6，35.7和38.3 mg/L。结果显示，用建立的多重PCR方法对BNoV、BAstV和BToV的最低检测限分别为1.34×104，1.06×104和1.03×104拷贝/μL(图3)。

图3 多重PCR的敏感性试验 M.DL2000 DNA Marker；1～7.BNoV 107～101 拷贝/μL，BAstV 107～101 拷贝/μL，BToV 107～101 拷贝/μL；8.阴性对照

2.4 重复性试验用建立的多重PCR方法对同一模板进行检测，3次试验结果一致(图4)，表明该方法具有良好的重复性。

图4 多重RT-PCR的重复性试验 A～C.第1，3,5周的PCR扩增结果；M.DL2000 DNA Marker；1.BNoV,BAstV和BToV；2.BAstV；3.BNoV；4.BToV；5.阴性对照

2.5 应用性检测用建立的多重和单一PCR对221份临床犊牛腹泻样品进行检测，其中多重PCR方法检测出的BNoV、BAstV和BToV的阳性数分别为22，40和42份， BNoV、BAstV和BToV的检出率分别为9.96%(22/221)，18.10%(40/221)和19.00%(42/221)，并检出BNoV、BAstV和BToV混合感染的样品2份(检出率为0.90%)(表2)，与单一PCR检测结果符合率为100%；表明该方法能够快速准确地检测此3种病毒的混合感染。

表2 临床样品的检测结果

3 讨论

随着我国养牛业的迅速发展，牛群数量逐渐增多，CD的发病情况也日益增多，生产中做到早发现、早诊断及早治疗显得尤为重要。由于其病因复杂(包括病毒、细菌和寄生虫等)，准确诊断成为成功控制CD的关键，因此，关于病毒性病原在CD病因中的角色与地位受到越来越多的关注[12-13]。

近年来，BNoV、BAstV和BToV等病毒在我国牛群中陆续被检测到。目前关于BNoV、BAstV和BToV[14]的检测方法鲜有报道，而能够同时检测这3种病毒的方法国内外尚无报道。因此，准确快速、特异性强和灵敏度高的诊断技术对这3种病毒的检测显得尤为重要。传统的病毒检测方法如病毒分离鉴定、电镜观察、血清学实验等，均存在费时费力、特异性差等弊端；PCR技术一直被广泛应用，并衍生出多重PCR等技术。多重PCR技术与单一PCR相比，具有高效性、系统性、经济简便性的特点。此外，多重PCR技术可同时检测多种病原体，在鉴别诊断上应用价值较大，尤其是混合感染[15]。BNoV、BAstV和BToV均属于RNA病毒，为建立多重PCR方法提供了便利。本试验所建立的多重PCR方法对BNoV、BAstV和BToV的最低检测限分别为1.34×104，1.06×104和1.03×104拷贝/μL，表明敏感性强。利用建立的多重PCR方法能从临床样本中扩增出BNoV、BAstV和BToV的核酸，并且与单一PCR检测结果符合率为100%；表明本试验建立的多重PCR方法可用于临床样品的检测与诊断，为检测BNoV、BAstV和BToV提供了新手段。同时，也解决了仅靠临床鉴别诊断难以判定的问题。虽然本试验3种病毒被同时检测到的检出率仅为0.90%，但也表明河南省牛群中存在混合感染的情况，为CD的治疗和预防带来一定难度，应引起足够重视。

本试验通过优化多重PCR的反应条件，建立的BNoV、BAstV和BToV多重PCR快速检测方法，能从粪便样品中成功检测出BNoV、BAstV和BToV，特异性强，敏感性高，重复性好，对BNoV、BAstV和BToV的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值，可为3种病毒的快速检测和流行病学调查等研究提供技术支持，为进一步研究BNoV、BAstV和BToV在犊牛病毒性腹泻中的相关致病机制及生物学关系提供了依据。同时由于CD病原复杂，故应进一步加强对其他引起CD病原的监测。