1,25(OH)2D3对猪伪狂犬病病毒诱导小鼠流产的影响

左玉柱，韩 磊，王 晶，袁广富，张建楼，范京惠*，仲 飞1，*

(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001;2.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001)

猪伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性、高度接触性传染病，临床症状主要表现为奇痒、发热和神经症状，妊娠母猪繁殖障碍、流产和死胎等[1- 2]。PRV属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科[3]。宿主较多，除猪外，还包括反刍动物、肉食动物和啮齿动物等[4]。自2011年以来，PRV的感染力增强，感染率不断上升，国内猪场伪狂犬野毒抗体阳性率居高不下，导致妊娠母猪的流产率和仔猪死亡率较高，对养猪业造成了较大的经济损失[5-6]。目前，临床上主要使用疫苗预防PR，尽管疫苗在防控PR的过程中起到了至关重要的作用，但目前疫苗免疫猪场的PR野毒抗体阳性率依然较高，因此，在防控PR的过程中，还应寻求其他辅助途径，与疫苗免疫配合使用，才能降低PR对猪场的危害。

1,25(OH)2D3，为维生素D3的活性物质，不仅参与免疫调节，还参与雌性生殖系统的调节，且具备一定的抗病毒作用[7-9]。然而，1,25(OH)2D3在抗PRV方面的作用，目前尚不明确。1,25(OH)2D3在体内的吸收和代谢与维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)是否表达及表达量的高低有关[10]。在雌性小鼠生殖系统中VDR存在于卵巢、输卵管和子宫中，并且该受体主要是在妊娠早期滋养层细胞中起到调节的作用[11]。为了开展1,25(OH)2D3在防控PRV引起母猪流产方面的研究，本试验使用不同剂量的PRV 感染小鼠，以确定引起感染小鼠流产的PRV最佳剂量；使用1,25(OH)2D3预处理小鼠研究生殖系统中VDR mRNA水平及PRV的量，阐明1,25(OH)2D3对PRV增殖以及小鼠流产的影响，为1,25(OH)2D3在抗PRV引起的母猪繁殖障碍方面的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 病毒和实验动物PRV(HB-BD株，25代)由河北农业大学动物医学院预防兽医学实验室分离，其gE基因GenBank登录号为MG738722。雌性昆明小鼠9～12 周龄，体质量(34±2) g，共95只；同龄雄性昆明小鼠30只，体质量(36±2) g。将小鼠在25℃条件下饲养并自由采食，自由饮水，饲养1周以适应环境。小鼠均购自北京斯贝福生物技术有限公司(SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.)。

1.2 主要试剂1,25(OH)2D3粉剂购自Sigma；TRIzol Reagent/RNA提取试剂，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT-Kit购自TaKaRa生物工程(北京)有限公司；2× SYBR Green qPCR Master Mix，Super GelRed®核酸凝胶染料购自US Everbright®Inc(苏州)。

1.3 引物设计根据GenBank登录的序列分别设计合成1对VDR检测引物VDR-1F/R和1对PRV的荧光定量PCR引物，并根据VDR扩增产物的测序结果，设计1对荧光定量PCR引物VDR-2F/R(表1)，引物均由生工生物工程(北京)有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 引起小鼠流产的PRV最佳接种量的确定将昆明雌鼠和雄鼠按2∶1合笼，合笼9 h后通过阴栓确定小鼠的妊娠情况，小鼠妊娠12 d左右时，将妊娠小鼠分为对照组(NC)和接种不同剂量PRV的流产模型组，每组8只妊娠小鼠。模型组小鼠分为低、中、高剂量组，分别注射0.25,0.35，0.40 mL 1 000 TCID50PRV，对照组给予等量的生理盐水，均颈背部皮下注射。注射后每隔6 h，观察小鼠流产和死亡情况，以确定引起小鼠流产的PRV最佳接种剂量。

1.5 1,25(OH)2D3对VDR表达量的影响待小鼠妊娠7 d时，使用不同质量浓度的1,25(OH)2D3处理，共分为4组：对照组(NC)，200，300，400 μg/kg 1,25(OH)2D3试验组，对照组给予等量的生理盐水，每组8只小鼠。注射后，每隔1 d 取2只小鼠检测子宫和卵巢中VDR的表达量，连续检测4次，以确定小鼠生殖系统中VDR量达到最高的时间以及1,25(OH)2D3最佳质量浓度。具体操作方法：将取得的子宫和卵巢按照TRIzol法提取组织总RNA，并使用反转录试剂盒对总RNA进行反转录得到cDNA，-80℃保存。以反转录的cDNA为模板，VDR-1F/R为引物进行PCR扩增，反应体系为20 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTPs 3 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 8 μL，模板4 μL。反应程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 25 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作步骤回收目的片段，并送上海生物工程有限公司测序，以确定扩增的目的基因为VDR。

VDR mRNA表达水平通过SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法检测，反应体系为20 μL：qPCR Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L),模板1 μL，用水补至20 μL。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。

1.6 1,25(OH)2D3对PRV引起小鼠流产的影响检测小鼠妊娠7 d 时，按照1.5方法，使用不同浓度的1,25(OH)2D3预处理小鼠后6 d，每只小鼠皮下注射1 000 TCID50PRV 0.35 mL。对照组小鼠使用生理盐水预处理。小鼠接种PRV后，每隔6 h，观察小鼠流产及死亡情况。

1.7 1,25(OH)2D3对PRV增殖及PRV引起的流产小鼠组织病理学影响确定小鼠生殖系统中VDR表达量最高的时间和1,25(OH)2D3最佳质量浓度后，妊娠7 d左右的小鼠，使用300 μg/kg 1,25(OH)2D3 预处理，预处理后6 d，接种0.35 mL 的1 000 TCID50PRV。共分为4组：对照组(NC)、1,25(OH)2D3试验组、PRV试验组和1,25(OH)2D3+PRV试验组，每组小鼠8只。注射PRV后，每隔6 h观察小鼠的流产和死亡情况。当PRV试验组小鼠出现流产症状后，处死所有小鼠，取小鼠卵巢和子宫，一部分提取核酸后，通过荧光定量PCR，检测1,25(OH)2D3对PRV增殖的影响；一部分使用SAKURA Tissue-Tek®O.C.T.Compound包埋，-20℃保存30 min后，制作冰冻切片，并进行HE染色。通过组织学病理切片观察，检测1,25(OH)2D3对PRV引起的流产小鼠组织病理学影响。

染色的具体步骤：将固定好的切片放在自来水中浸泡约1 min，苏木精染液中染色3 min，盐酸乙醇分化10 s，自来水浸泡30 s，伊红染液染色1 min，自来水浸泡30 s，70%，80%，90%，100%酒精脱水各1 min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各染色15 min，最后用中性树胶封片，室温放置，镜下观察流产小鼠卵巢、子宫的病理变化。

2 结果

2.1 引起小鼠流产的PRV最佳接种量的确定小鼠妊娠12 d 时，分别颈背部皮下注射不同剂量的PRV。与接种生理盐水的对照组相比，低剂量组小鼠在攻毒后的54 h逐渐出现了奇痒，注射部位因小鼠抓咬而被毛脱落，72 h 开始出现了死亡，84 h 时小鼠死亡4只，其中2只小鼠出现流产症状；中剂量组小鼠接种病毒后48 h 开始出现奇痒，并伴随有流产症状，随着时间的延长，流产小鼠数量增多，至84 h 流产6只。高剂量组的主要症状为奇痒，小鼠在接种PRV后36 h出现奇痒症状，之后精神萎靡，接种后48 h开始出现死亡，至72 h全部死亡，3只出现流产症状(图1，2)。结果显示，PRV可引起妊娠小鼠流产，且注射0.35 mL 1 000 TCID50PRV的小鼠出现流产的时间较早、症状最显著，为诱导小鼠流产的最佳接种剂量。

图1 PRV攻毒后60 h小鼠临床症状 A.对照组;B.低剂量组;C.中剂量组;D.高剂量组

2.2 1,25(OH)2D3对小鼠VDR表达量的影响小鼠妊娠7 d左右时，使用不同浓度的1,25(OH)2D3预处理的妊娠小鼠，每隔1 d 取2只小鼠检测生殖系统内VDR mRNA含量。将取得的卵巢和子宫提取RNA并反转录为cDNA，普通PCR扩增结果与目的条带大小一致，且测序结果与GenBank登录的VDR序列比对一致。经荧光定量PCR分析结果显示，与对照组(NC)相比，注射不同浓度1,25(OH)2D3的妊娠小鼠卵巢和子宫VDR mRNA表达水平均有所提高，且在注射后6 d达到最高。与其他1,25(OH)2D3预处理组比较，300 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理的小鼠在6 d 时VDR mRNA表达水平最高(图3)。

图2 PRV感染小鼠的流产及存活情况 A.小鼠流产情况;B.小鼠存活情况

图3 不同剂量1,25(OH)2D3处理小鼠生殖系统的VDR mRNA表达水平

2.3 1,25(OH)2D3对PRV引起小鼠流产的影响的检测对不同质量浓度(200，300，400 μg/kg) 1,25(OH)2D3预处理的小鼠接种PRV后，连续监测108 h，每隔6 d观察1次。观察发现，经200 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理的小鼠出现流产的时间延缓至60～72 h，300 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理的小鼠出现流产的时间延缓至66～72 h，400 μg/kg 1,25(OH)2D3 预处理的小鼠出现流产的时间延缓至60～72 h。此结果与生理盐水预处理的PRV感染小鼠出现流产的时间(48～60 h)相比较，显著延迟小鼠的流产时间(图4A)。同时，高、中、低剂量1,25(OH)2D3处理的小鼠流产率分别为50%，50%，62.5%,而生理盐水预处理组小鼠的流产率则达到87.5%(图4B)。结果表明，用1,25(OH)2D3预处理怀孕小鼠，可延缓PRV引起的小鼠流产时间，降低小鼠的流产率，且300 μg/kg 1,25(OH)2D3作用效果最显著。

图4 1,25(OH)2D3对PRV感染小鼠流产的影响 A.小鼠流产的时间分布; B.小鼠的流产率

2.4 1,25(OH)2D3对PRV引起的流产小鼠组织病理学影响妊娠7 d的小鼠，用300 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理6 d后感染0.35 mL 1 000 TCID50PRV。当PRV试验组小鼠出现流产症状后，处死所有小鼠，取卵巢和子宫制作切片，进行组织病理学观察。结果显示：对照组(NC)卵巢黄体明显，有较多发育成熟的卵母细胞，子宫内膜皱褶较多且呈明显的波浪形，子宫内膜腺体多；1,25(OH)2D3组小鼠的卵巢和子宫的组织学变化与对照组相似；PRV组小鼠可见卵母细胞形状不规则，卵泡内有大量的红细胞，卵泡之间界限模糊，子宫内膜皱褶减少，较平坦，子宫腔变窄，腺体减少甚至消失，红细胞增多；1,25(OH)2D3+PRV试验组与PRV组相比，小鼠卵泡界限较明显，卵泡腔内颗粒细胞增多，红细胞数量减少，子宫腔内红细胞数量减少或消失，子宫内膜皱褶增多，皱褶间的空腔增多(图5)。结果表明，1,25(OH)2D3可有效地减轻PRV感染小鼠的病理变化。

图5 1,25(OH)2D3对PRV引起的流产小鼠卵巢(A～D)和子宫(E～H)的组织病理学观察结果(HE染色×40) A，E.对照组(NC);B，F.1,25(OH)2D3试验组;C，G.PRV试验组;D，H.1,25(OH)2D3+PRV试验组

2.5 1,25(OH)2D3对PRV增殖的影响按照方法1.7处理后小鼠的子宫和卵巢，提取核酸后，通过荧光定量PCR检测PRV的量，结果显示，与PRV组相比，经300 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理的小鼠生殖系统中PRV的量明显降低(图6)。

图6 1,25(OH)2D3对 PRV增殖的影响

3 讨论

PRV自1947年在我国首次报道以来，已在全国广泛存在和流行[4]，已成为影响养猪业健康发展的重要病原。PRV引起的怀孕母猪流产是造成猪场经济损失的重要因素，因此有效抑制病毒在怀孕母猪体内增殖，降低流产率，是有效防控PR的措施之一。

1,25(OH)2D3为维生素D的活性成分，可参与多种细胞的调控[12]，具有抗病毒、抗肿瘤细胞的增殖和抗炎作用[12-14]。另外，1,25(OH)2D3还可促进胎盘滋养层细胞和蜕膜细胞合成VDR，维持雌性正常妊娠[10-11，15]。因此，研究1,25(OH)2D3对PRV感染引起的怀孕母猪流产的影响，将有助于PR的防控。由于PRV可引起小鼠流产、奇痒、全身的炎症反应和死亡[16-17]，因此，本试验开展了1,25(OH)2D3对PRV引起小鼠流产的抑制效果研究。

PRV感染试验显示，相较于其他剂量的PRV感染组，妊娠7 d的小鼠在接种0.35 mL 1 000 TCID50PRV后出现了明显的流产症状，为诱导小鼠流产的最佳病毒量。

1,25(OH)2D3在体内的吸收和代谢与VDR是否表达及表达量的高低有关[10]。为了确定1,25(OH)2D3在怀孕小鼠体内有效吸收的使用量，本研究分别使用不同量的1,25(OH)2D3处理妊娠7 d 左右小鼠，并对小鼠生殖系统内VDR mRNA表达量进行检测。结果显示，经不同浓度1,25(OH)2D3处理后，妊娠小鼠的VDR mRNA表达量均高于生理盐水处理的对照组，且300 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理的小鼠在6 d 时VDR mRNA表达量最高，为1,25(OH)2D3对PRV引起的小鼠流产影响的研究中1,25(OH)2D3使用量的选择提供了依据。

为了确定1,25(OH)2D3对PRV引起的小鼠流产有何影响，以及产生的影响与1,25(OH)2D3剂量之间的关系，妊娠7 d左右的小鼠分别使用不同量的1,25(OH)2D3预处理，并在预处理后的6 d 接种0.35 mL 1 000 TCID50PRV，结果发现，1,25(OH)2D3可使小鼠出现流产的时间延迟，流产率降低，死亡率降低，且300 μg/kg 1,25(OH)2D3预处理组的作用最为明显。说明1,25(OH)2D3能降低PRV 引起的小鼠流产率和死亡率，且该作用的大小与小鼠体内的VDR表达量有关。

1,25(OH)2D3能抑制病毒的复制，在抗病毒研究中起着重要作用[18]。为了确定1,25(OH)2D3降低小鼠的流产率是否与抑制病毒的增殖及降低PRV对感染小鼠生殖系统的损伤有关，本试验在PRV感染组小鼠出现流产后，对所有试验组小鼠子宫和卵巢进行了组织病理学检查和PRV量的检测，结果显示，经1,25(OH)2D3预处理的小鼠子宫病理变化程度及PRV量明显低于未处理组。有研究表明，1,25(OH)2D3可增加大鼠子宫质量，并促进子宫内膜至蜕膜分化[19-20]，维持正常妊娠的过程。本试验中，1,25(OH)2D3预处理组小鼠相较于未处理组，卵泡界限较明显，卵泡腔内颗粒细胞增多，红细胞量减少；子宫腔内红细胞数量减少或消失，子宫内膜皱褶增多，皱褶间的空腔增多。提示1,25(OH)2D3参与小鼠正常妊娠的调控。而1,25(OH)2D3预处理组PRV的量比未处理组低，与KUMAR等[12]的体内高水平的1,25(OH)2D3可抑制病毒的复制研究结果相一致。HUANG等[18]研究表明，1,25(OH)2D3可通过自噬或炎性反应抑制病毒的复制，本试验中1,25(OH)2D3对PRV增殖的抑制，是否也是通过诱导自噬或炎性反应的方式，有待进一步研究。