散结通脉方对ApoE-/-小鼠AS 斑块逆转和消退的作用机制研究

丁云录，李 卓，成光宇，刘爱东

（长春中医药大学附属医院，长春 130021）

“散结通脉方”为全国名中医黄永生教授临床经验方，临床使用逾20 年，疗效确切，临床依据充分。本方逆转冠状动脉粥样硬化斑块有确切的疗效，具有进一步开发与研究的价值和意义。本课题通过建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，从主动脉斑块逆转、消退及血清TNF-α、ox-LDL、ET-1 和IL-10 含量等方面探讨痰瘀同治法稳定易损斑块的可能机制，进一步确证中医药的作用靶点及治疗机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 实验动物，SPF 级8 周龄ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60 只，分笼饲养，室温（23±1）℃，相对湿度50%，通风良好，室内12 h 明暗自动切换（光照时间7:00～19:00）。动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。药品及试剂，散结通脉方浸膏，性状：处方14 味药，棕褐色至棕色浸膏，气微，味苦。批号：20180329，长春中医药大学附属医院实验研究中心提供。阿托伐他汀钙片，规格：每片10 mg，每盒7 片，批号：20171221，国药准字H20133127，浙江新东港药业股份有限公司产品。戊巴比妥钠，规格：每瓶500 mg，批号：WXBB6772V，美国Sigma 公司产品。胆固醇，规格：分析纯，每瓶500 g，批号：LOT5AF10250，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；胆酸钠（猪），规格，分析纯，每瓶500 g，批号：K01N8B47111,上海源叶生物技术有限公司产品。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒，规格：每盒96 T、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）试剂盒，规格：每盒96 T、内皮素-1（ET-1）试剂盒，规格：每盒96 T、白细胞介素-10（IL-10）试剂盒，规格：每盒96 T，批号：E20190601A，均购自美国RD 公司。仪器及器材 光学显微镜，型号：OlympusBX51，日本 Olympus 公司产品；图像分析系统，型号：NIS-ELEMNT BR，日本NIKON 公司产品；石蜡切片机，型号：Leica RM2255，德国 Leica 公司产品；酶标仪，型号：BIO680，Japan BIO RAD 公司产品；台式高速低温离心机，型号：Biofuge Stratos，德国贺利氏公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 选用8 周龄ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60 只。小鼠予普通饲料适应性喂养1 周后，随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照药阿托伐他汀钙49.5 mg·kg-1·d-1给药剂量组；散结通脉方设高剂量（13.5 g·kg-1·d-1）、中剂量（6.75 g·kg-1·d-1）和低剂量（3.40 g·kg-1·d-1）3 个给药剂量组，共6 组，每组10 只。

1.2.2 造模及给药 建立动脉粥样硬化斑块模型，除正常对照组外，其余实验组均饲以高脂饲料（2%胆固醇、0.4%胆酸盐、10%脂肪、69.6%普通饲料）喂养12 周。实验期间自由摄食饮水，节律光照。造模同时灌胃给予供试药品混悬液，正常对照组及模型对照组灌胃给予蒸馏水。每3 日称量各组小鼠体质量1 次，以调整给药量[1-5]。

1.2.3 麻醉及取材 实验周期结束，禁食12 h，1%戊巴比妥0.5～1.0 mL腹腔麻醉，眼眶采血，室温静置1 h，4℃下3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，-80 ℃冻存备用。血样采集结束后进行剖检，大体观察后，分离剪取主动脉弓，放入4%多聚甲醛固定。

1.2.4 检测指标 主动脉AS 斑块指标。标本制作，剪取小鼠主动脉弓，4%多聚甲醛固定，经自动脱水机脱水后包埋，石蜡切片机切片，每张切片厚度为5 μm。苏木素伊红染色，脱蜡，苏木素染色，1%盐酸乙醇分化，0.5%伊红液染色，脱水，中性树胶封片。根据苏木素伊红染色结果，10 倍镜下观察所有斑块，每只小鼠均选取斑块面积最大的1 张切片测量，应用面积分析软件，测量出斑块面积（mm2）、血管横截面面积（mm2）、脂质空泡面积（mm2），计算，斑块相对面积＝斑块面积/血管腔面积。相关细胞因子检测：采用ELISA 试剂盒测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、内皮素-1（ET-1） 及白细胞介素-10（IL-10）水平。原理：夹心法酶联免疫吸附试验，检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS 洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应经PBS 的彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅表现出样品中相关的细胞因子水平。

1.3 统计学方法 所列数据以均数±标准差（）表示，统计学处理方法采用组间t检验。

2 结果

2.1 各组对ApoE-/-小鼠AS 模型主动脉斑块的影响 见表1。

2.2 各组对ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影响 见表2。

表1 各组对ApoE-/-小鼠AS 模型主动脉斑块的影响（，n =10）

表1 各组对ApoE-/-小鼠AS 模型主动脉斑块的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 各组对ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影响（，n =10）

表2 各组对ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 讨论

动脉粥样硬化形成时，脂代谢紊乱，ox-LDL 含量异常升高，导致血管内皮功能受损，细胞活化，分泌TNF-α、IL-6、IL-10 等多种致炎性因子，加重血管壁的炎症[6-8]。单核巨噬细胞分泌TNF-α，促使单核细胞摄取ox-LDL，导致泡沫细胞的形成，泡沫细胞、内皮细胞的坏死和调亡，平滑肌细胞的增殖，移行和细胞外基质增生，最终生成粥样斑块。另外，长期脂质代谢紊乱会刺激血管内皮细胞活性氧簇（ROS）的产生和蓄积，引起内皮细胞损伤、坏死，影响血管内皮NO 和ET-1 的分泌，血管内皮细胞生成的ET-1 具有很强的血管收缩作用，研究发现它与人类很多疾病有关，这其中就包括动脉粥样硬化、高血压等[9-11]。本研究发现，散结通脉方干预后，动脉粥样硬化模型小鼠血清TNF-α、ox-LDL、ET-1 和IL-10 含量均可明显降低，表明散结通脉方能调节介导的巨噬细胞调亡和泡沫化的进程，维持血管内皮结构和功能的完整，延迟动脉粥样硬化炎性进程，对治疗动脉粥样硬化具有极为重要的意义。

本研究结果显示，散结通脉方的干预与血清炎性因子水平下调和主动脉斑块面积、脂质空泡面积及斑块相对面积缩小相关，说明散结通脉方具有治疗动脉粥样硬化的作用。