大疱性类天疱疮患者皮损和血清中MMP-2的表达

张海祥，秦兰英，石晓旭，赵子申，叶文静，刘婕，李丙南，曹娜，张群

（沧州市人民医院，河北沧州061000）

目前据国外研究表明基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）在许多大疱类皮肤病的皮损中均有阳性表达或发挥着重要作用。如：在家族性良性慢性天疱疮中角质形成或分离细胞周围的细胞中MMP-9被阳性染色；MMP-12在寻常型天疱疮皮损和大疱性类天疱疮皮损中均检测到；MMP-9可能参与寻常型天疱疮的棘层松解[1-4]。大疱性类天疱疮（Bullous pemphigoid，BP）是一种获得性自身免疫性大疱类皮肤病[5]。目前认为抗BP180的抗体是主要的致病抗体，抗BP180抗体通过补体激活、中性粒细胞募集和蛋白酶的释放，破坏半桥粒和细胞外基质成分，在基底层的透明板内发生真表皮的分离，引起表皮下水疱。MMP-2又称白明胶酶A，能降解明胶和Ⅳ型胶原纤维，二者是基底膜的主要组成成份[6-7]；也能降解其他基质蛋白：Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ型胶原、核心蛋白聚糖、弹力蛋白和纤维连接蛋白等[5，8-10]。真皮和表皮的分离必然伴随着细胞基质的降解，提示MMP-2可能在BP的发生和发展过程中发挥着重要的作用。因此，笔者检测了MMP-2在BP皮损和血清中的表达，从而进一步探讨MMP-2在BP发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例与标本 24例BP患者的皮损和血清，女 10例，男14例。年龄 44～87岁，平均（67.4±15.0）岁；均来自沧州市人民医院皮肤科，经临床、组织病理、直接免疫荧光、间接免疫荧光确诊为BP，且均未接受过治疗。正常对照组15例，女7例，男8例，年龄28～81岁，平均（59.9±13.6）岁，均为沧州市人民医院整形外科非免疫皮肤病患者，均为健康志愿者。

1.1.2 试剂 鼠抗人MMP-2单克隆抗体（美国R&D）；山羊抗鼠IgG的SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；人MMP-2酶联免疫吸附测定（ELISA）法试剂盒（R&D）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化学染色 所有皮肤标本经10%中性甲醛常规固定、石蜡包埋，制成4 μm厚连续切片；将切片置于60℃烤箱烘烤；脱蜡水化；磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，0.1%的柠檬酸钠溶液中高压热修复；PBS冲洗，滴加3%的过氧化氢去离子水；PBS冲洗，滴加一抗（鼠抗人MMP-2单克隆抗体）过夜；PBS浸洗，滴加生物素标记的IgG工作液；PBS浸洗，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液；PBS浸洗，滴加DAB辣根过氧化物酶显色试剂显色，复染；封片后镜下观察并扫描，图像分析，拍照。严格按Sp试剂盒操作说明操作。真表皮交界处细胞被染成棕黄色为阳性，正常皮肤无着色或着色不明显。染色结果分析：高倍镜（40×10）下用网形目镜测微尺单盲法计数5个视野的阳性细胞的均数。所有操作均有同1名实验者判断。

1.2.2 ELISA 加100 μL试验稀释剂 RD1-34到每个孔里；向各孔加100 μL标准品、对照或样本，放在摇板上孵育2 h；冲洗4次，向各孔加200 μL二抗，放在摇板上孵育1 h；冲洗4次，向各孔加200 μL 染色液，放置 30 min，避光；向各孔加 50 μL终止液；450 nm波长下检测，并建立标准曲线，取得MMP-2的血清浓度。严格按ELISA试剂盒操作说明操作。通过酶标仪读取结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS统计软件包进行统计。先行方差齐性检验，然后正常组和对照组之间应用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义；两变量之间的相互关系用Pearson相关。

2 结果

2.1 免疫组化染色 MMP-2在BP患者皮损中主要表达于皮肤的表皮层，真皮层的炎性细胞也有少量表达，在疱液中也有明显表达，呈棕黄色颗粒状；在对照组的皮肤组织中MMP-2也有较弱表达，见图1。在高倍镜（40×10）的视野内，BP患者皮损中MMP-2的表达较对照组显著增加，BP皮损与正常人皮肤MMP-2的表达差异有统计学意义（t=5.95，P＜0.01），见表 1。

表1 MMP-2在BP患者皮损与正常对照组皮肤中的表达[每高倍镜（40×10）视野的阳性细胞数]

2.2 ELISA 24例BP患者血清和24例对照组血清经ELISA实验，通过酶标仪读取结果，结果显示血清MMP-2的平均水平在BP患者组为（38.54±23.00）ng/mL，在正常对照组为（17.51±5.45）ng/mL。BP组显著高于正常对照组，2组比较差异有统计学意义（t=4.36，P＜0.01），见表 2。

表2 MMP-2在BP患者组与正常对照组血清中的分泌水平 （ng/mL，±s）

表2 MMP-2在BP患者组与正常对照组血清中的分泌水平 （ng/mL，±s）

组别 n images/BZ_8_459_1343_481_1387.png±s P BP 组 24 38.54±23.00 0.05对照组 15 17.51±5.45

2.3 比较同1例BP患者皮损中表达MMP-2的细胞数目和血清中MMP-2的分泌水平，统计学方法为Pearson相关，结果显示二者之间无明显的相关性（γ=0.005，P=0.982）。

图1 免疫组化染色结果：MMP-2的表达情况（DAB 染色×400）

3 讨论

目前据国外研究表明BP的发病机制与基底膜组份的破坏有关。自身抗体结合表皮基底膜的抗原，激活补体和水解酶等，导致水疱的形成。一些研究已经表明MMP参与了BP的皮损的发生，然而在具体过程中的作用尚不清楚[5]。MMP-2和MMP-9被检测到在表皮、基底层角质形成细胞和水疱部位均有表达[11]。有报道表明表皮与真皮分离发生在基底层，伴随着大量的炎性渗出物和半桥粒及细胞外基质成分的降解，炎性细胞的蛋白水解酶参与了BP水疱的形成，较高水平的蛋白水解酶，包括MMP-2、MMP-9等已经被检测到在BP的疱液中和皮损中表达[12]。

MMP是一族锌依赖性内肽酶，可降解细胞外基质中各种蛋白成分，基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）能特异性抑制其活性。二者是细胞外基质合成及代谢平衡中2个重要的酶系，参与多种与细胞外基质蛋白水解重塑有关的生理过程，如组织发生、组织修复、血管形成等。多种细胞因子、细胞外基质成分、致癌物、原癌基因产物如表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素（IL）-1、c-fos和c-jun的表达产物能促进多种MMP mRNA的转录[13]。

MMP-2是MMPs家族中的重要成员，也是发现较早的因子，又称明胶酶或Ⅳ型胶原酶，是临床最重要的明胶酶之一。MMP-2基因位于人类染色体6q21，由13个外显子和12个内含子组成，其结构基因总长度为27 KB，相对分子质量为72 kD。MMP-2可由体内多种细胞合成和分泌，包括成角质细胞、内皮细胞、纤维细胞及软骨细胞等。但MMP-2无活性，以ProMMP-2的形式分泌，经过水解后才被激活。MMP-14与TIMP-2协同作用催化MMP-2成为活性形式[14]。

本研究结果显示BP患者皮损和血清中MMP-2的表达均明显增加，提示MMP-2可能在BP的发病机制中起重要作用。但MMP-2的变化是否有诊断和治疗上的指导意义暂时还不确定。BP患者皮损和血清中MMP-2高表达的机制可能与BP180在基底膜带介导抗原抗体反应有关。在补体和炎性反应的刺激下，导致MMP mRNA的转录增加，进一步促进ProMMP-2合成，合成增多的ProMMP-2继而被水解激活，导致MMP-2的高表达，而高表达的MMP-2可以降解明胶和Ⅳ型胶原纤维等基质蛋白，从而可能使表皮和真皮在基底带发生分离，导致表皮下水疱的形成。此外根据试验结果发现，在同1例患者的血清和皮损中MMP-2的表达无明显的相关性，考虑可能与疾病的发展阶段，病情的轻重及皮损取材部位有一定关系。