不同培养基配方对酸枣组培苗生长的影响

卢登洋，杨彦强，张乔乔，闫芬芬，林彩霞*，吴翠云*

（1 塔里木大学植物科学学院/兵团南疆特色果树高效优质栽培与深加工国家地方联合工程研究室，新疆阿拉尔 843300；2 新疆生产建设兵团第二师农业科学研究所）

酸枣（Ziziphus acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus Mill.）植物，原产中国华北，又叫“野枣”[1]。酸枣是具广阔开发利用前景的野生果树资源，也是重要的中药材资源，含有丰富的蛋白质，钙、磷、铁等矿物质和多种维生素等营养物质，同时含有三萜烯酸、氯原酸、黄酮类化合物等药用成分[2-5]。酸枣不仅可以绿化荒山，保持水土，还可作枣树的砧木、育种的原始材料[6]。酸枣作为我国特有的生态经济型树种，主要处于野生状态，近年来出现了人工栽培的势头，但由于缺乏良种，严重限制了产业发展[7]。在此形势下，酸枣组织培养则提供了快速培育良种苗木的有效途径。近年来，科研工作者们对葡萄柚、黄连木、白芨、金线莲、香樟的快速繁殖进行了大量研究。关于酸枣组培快繁技术研究却鲜见报道，因此快速培育良种苗木，是当前亟需解决的重要科学问题。本研究以酸枣种子在离体培养条件下萌发的幼苗为外植体，研究不同培养基配方对不定芽诱导、增殖及生根的影响，为将来开展酸枣砧木育种及其无性系砧木的繁育提供条件，并为开展酸枣幼苗相关研究提供均一试验材料，为酸枣的快速繁育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料为9 月份采自山西省晋中的野生成熟酸枣果实。自然阴干后，置室内干藏，在试验前3d 脱去果皮和种皮，同时取出种仁备用。

1.2 试验方法

1.2.1 初代培养。酸枣种仁处理采用3 因素2 水平试验设计方案，即自来水浸泡时间（12h、24h）、次氯酸钠消毒浓度（1%、2%）和消毒的时间（10min、20min），采用全组试验，共计9 个处理，每处理接种6 瓶，每瓶接种酸枣种仁5 粒。每个处理接种量为30 粒种子。

选取大小一致，饱满无损伤的酸枣种子，用自来水溶液浸泡，无菌水冲洗2～3 次，75%酒精浸泡30s，不同浓度次氯酸钠溶液振荡消毒处理，无菌水冲洗2～3 次，剥去种皮后分别接种于MS 培养基中，置于25±2℃、2500Lx 光照强度和14h 光照10h 黑暗条件下培养。

在接种后第3d，应用计数法分别查出每个处理的培养基中酸枣种子萌发的个数（以芽长超过种子长度的1/2 为发芽标准）计算萌发率，以及每个处理的培养基中酸枣种子污染的个数，并计算污染率。

计算公式：萌发率（%）=萌发数/接种数×100；污染率（%）=污染数/接种数×100。

1.2.2 继代培养。于初代培养酸枣无菌苗中选择健壮单株，切取茎段置于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L 培养基中进行多代转接，繁殖获得150 株无性株系，将其分成5 组，分别转接到5 个不同继代培养基：S1：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；S2：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L；S3：MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1mg/L；S4：MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L 和 S5：MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.1mg/L，每个处理接种30 株。接种后每隔5d 观察幼苗生长变化，数出叶片数，用直尺测量幼苗子叶到生长点的高度，统计增殖数，并计算酸枣幼苗株高净增加量、叶片数增加量和增殖数增加量。

计算公式：酸枣幼苗株高净增加量=每次观察株高-初始株高；酸枣幼苗叶片增加量=每次观察叶片数-初始叶片数；酸枣幼苗增殖数增加量=每次观察增殖数-初始增殖数。

1.2.3 生根培养。选择继代培养中健壮植株转接到生根培养基中，设置6 个不同激素浓度的生根培养基：R1：1/2MS+IBA 0.1mg/L；R2：1/2MS+IBA 0.3mg/L；R3：1/2MS+IBA 0.5mg/L；R4：1/2MS+IBA 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L；R5：1/2MS+IBA 0.3mg/L+IAA 0.1mg/L 和R6：1/2MS+IBA 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L，每个处理30 株。转接培养后，每隔5d 观察幼苗生长变化，数出叶片数，用直尺测量幼苗子叶到生长点的高度，数出增殖数和根系数，计算酸枣幼苗株高净增加量、叶片增加量和增殖数增加量，用根测仪测定酸枣根系长度和根系粗度。

计算公式：酸枣幼苗株高净增加量=每次观察株高-初始株高；酸枣幼苗叶片增加量=每次观察叶片数-初始叶片数；酸枣幼苗增殖数增加量=每次观察增殖数-初始增殖数。

1.2.4 数据统计与分析。使用Excel 2010 软件对调查数据进行统计分析，DPS 作方差分析。

2 结果与分析

2.1 初代培养中不同消毒处理对酸枣种仁灭菌效果的影响

由表1 可知，从萌发率来看，酸枣种仁在不同消毒处理下，萌发率差异不大。从污染率来看，处理5、6、7、8 的酸枣种仁污染率低于其他5 个处理，污染率最低为3.33%。从萌发率和污染率综合分析来看，处理5 较好，其萌发率达到96.87%，污染率为3.33%，说明处理5 是最适宜初代培养中酸枣种仁灭菌的培养基。

表1 不同消毒处理对酸枣种仁灭菌效果的影响

2.2 继代培养中不同培养基配方对酸枣幼苗生长的影响

2.2.1 继代培养中不同培养基配方对酸枣株高的影响。由图1 可知，酸枣幼苗在不同继代培养基配方下，株高增加量均随着转接天数增加呈上升趋势，但各培养基配比间酸枣株高存在显著差异。随着转接天数的增加，S2培养基中株高净增长量明显高于其他培养基。且在转接第25d 时，S2酸枣株高增加量是S3培养基配方中的1.18 倍，说明S2培养基有利于促进酸枣幼苗株高的生长。

图1 培养基配方对酸枣株高净增加量的影响

2.2.2 继代培养中不同培养基配方对酸枣叶片的影响。由图2 可知，在转接后第10d，离体培养酸枣幼苗叶片增长量在各培养基配方间无显著性差异，转接20d 之后，S1、S2、S3和S4、S5有显著差异，转接第25d 时，S2培养基中酸枣幼苗与叶片增长量最高，而S5培养基中的最低，相差3.35 张。说明S2培养基配方有利于酸枣叶片的增长。

图2 培养基配方对酸枣叶片增加量的影响

2.2.3 继代培养中不同培养基配方对酸枣增殖数的影响。不同继代培养基配方中酸枣幼苗增殖数变化情况见表4，随着培养天数的增加，酸枣幼苗增殖数量逐渐上升，但各培养基配比间幼苗增殖数存在差异。在转接25 d 时，S2培养基配方中酸枣幼苗增殖数增加量是S4培养基配方的1.41 倍，说明S2培养基有利于促进酸枣幼苗分化生长。

由图1～3 综合比较可知，虽然S1培养基配方中酸枣幼苗叶片增加量略高于S2，但从继代培养的丛生芽数来看，研究认为S2培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L 是最适宜快速繁殖酸枣幼苗的继代培养基。

图3 培养基配方对酸枣幼苗增殖数的影响

2.3 生根培养中不同培养基配方对酸枣生长的影响

由表2 可知，从激素类型来看，只附加IAA 的培养基生根率明显低于附加了IAA 和IBA 的生根率。从生根率、平均根数和平均根长综合比较分析，IAA 0.3mg/L 的培养基上，虽然生根率达到76.67%，但由于根部愈伤组织较大，生根数较少，且着生在愈伤组织上，出苗时易脱落，易造成成活率低。而在附加IAA 0.1mg/L 和IBA 0.5mg/L 的培养基上，其生根率达到88.89%，生根数与平均根长指数也较高。因此认为1/2MS+IAA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L 培养基是酸枣快速繁殖生根培养的适宜培养基。

表2 生根培养基配方对酸枣根系生长的影响

3 讨论

在植物组织培养工作中，无菌外植体的获取具有十分重要的意义。酸枣种子相对较小，操作较困难，灭菌和消毒不彻底易造成污染，最终会影响无菌幼苗的繁殖。对于种子灭菌，鲁松等[8]采取了2 因素3 水平完全随机试验设计，设置75%酒精（处理时间30s、45s、60s）、0.1%HgCl2（处理时间8min、10min、15min）各3 个水平来达到有效灭菌的目的。研究通过3 因素2 水平试验设计方案，3 因素2 水平试验方案为自来水浸泡时间（12h、24h）、次氯酸钠消毒浓度（1%、2%）和消毒时间（10min、20min）来控制污染，这与鲁松等采用的灭菌方法相比，更简便，成本更低，更适合酸枣无菌苗的快速繁殖。

在继代培养中，6-BA 和IBA 的组合使用比较常见[9-10]。叶维雁等[11]在诱导培养研究中认为，6-BA 最佳浓度为0.5mg/L，高于该浓度的处理其诱导能力下降。研究结果表明，在诱导培养的最适培养基中添加少量的IBA（0.1mg/L），增殖系数较高，与叶维雁等[11]的研究结果不一致。叶晓青研究表明[12]，可以通过降低细胞分裂素浓度来维持较高的平均繁殖系数，同时又保持较好的生长势，因此有待进一步研究。马媛春[13]研究认为继代的次数不一定是越多越好，随着继代次数的增加，组培苗体内的激素也会慢慢积累，从而抑制组培苗增殖。因此在研究酸枣组培苗继代时，定期对继代的组培苗进行更换培养基，或者及时进行再次初代培养，从而避免了这方面问题。

在大部分生根研究中，生根的基本培养基均采用1/2MS 培养基[14-15]，即降低无机盐的浓度，沈春修[16]在长寿花的快速繁殖体系中也提到了低盐浓度的培养基有利于根的生长，生长素对根的生长效应较明显。因此，本研究仍采用低盐的1/2MS 培养基进行生根研究，并附加不同浓度的IAA 和IBA 诱导根的形成。其中欧阳磊[17]认为添加IBA 0.5mg/L 的生根培养基上杉木的生根率较高，生根时间较短，出根早、根系生长健壮，而且根长适中。而王力等[18]研究认为兴化龙香芋不定芽诱导生根的最佳培养基为1/2 MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L 活性炭+30g/L 蔗糖。研究在附加IAA0.1mg/L和IBA0.5mg/L 的培养基上，生根率达到88.89%，生根数与平均根长指数也较高。与欧阳磊等[17]的结果不一致，可能是树种不同而引起的差异。生根培养中叶片数增加量和增殖数增加量在15～20d 中呈现下降趋势的原因是酸枣植株未生根前从培养基中吸收的养分不足，导致生长点干枯。待根系长出后，从培养基中吸取养分从而长出新的生长点。

4 结论

综上所述，酸枣种子经预处理后，用自来水浸泡12h，75%酒精消毒30s，1%和2%的次氯酸钠各振荡10min，剥去种皮的消毒效果较好，污染率为3.30%，成活率为96.60%；丛生芽诱导的最适培养基配方为MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L；最适宜的生根培养基为1/2 MS+IAA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L，生根率是88.89%。该研究筛选获得了酸枣组织培养的最佳外植体及各培养阶段的最佳培养基配方，研究结果能有效提高愈伤组织诱导成功率、缩短种苗生产周期。