艰难梭菌在老年Ⅱ型糖尿病住院患者粪便样品中检测率及临床意义

袁宝玉，武强，周聪，张慧，徐茂锁，齐伟强，沈芳

复旦大学附属上海市第五人民医院检验科，上海200240

艰难梭菌(clostridium difficile) 是医院感染重要病原菌[1]，若未及时控制，可能导致患者住院时间延长、病死率升高、医疗费用增加。已有研究表明无症状携带者与艰难梭菌传播及感染暴发密切相关[2,3]。目前我国人口老龄化问题日趋严重，Ⅱ型糖尿病是老年人常见病、多发病。关于老年患者，特别是老年糖尿病患者艰难梭菌无症状携带情况研究少见。本研究对老年Ⅱ型糖尿病住院患者粪便样本进行艰难梭菌分离与鉴定，初步探讨其临床意义。

1 对象和方法

1.1 一般资料 收集2019年3月-11月复旦大学附属上海市第五人民医院内分泌科264 例≥60 岁Ⅱ型糖尿病住院患者。诊断标准[4]：典型糖尿病症状(烦渴多饮、多尿、多食、不明原因体重下降) 加随机血糖≥11.1mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或葡萄糖负荷后2h 血糖≥11.1 mmol/L。排除标准：(1) 其他类型糖尿病；(2) 严重肝肾功能不全；(3) 心、脑、呼吸系统等严重疾病。本研究获得本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 材料 艰难梭菌CDMN 选择性培养基(英国Oxoid公司)；DNA 提取试剂盒(天根生化科技(北京) 有限公司)；PCR 试剂盒(日本TaKaRa 公司)；PCR 扩增仪(德国Eppendorf 公司)；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析仪(德国Bruker Daltonics 公司)；引物设计和测序(生工生物工程(上海) 股份有限公司)；XN9000 全自动五分类血液分析仪及配套试剂(日本Sysmex 公司)；Cobas 8000 全自动生化免疫分析仪及配套试剂(瑞士罗氏公司)。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离、培养及鉴定 取1g 新鲜粪便样本置于离心管中，加入等体积无水乙醇，震荡，3 500 r/min离心15min，取沉淀接种于CDMN 平板上，37℃厌氧培养24～48h，每平板挑3～5 个典型菌落用质谱仪鉴定并保存菌株。所有操作均按照《全国临床检验操作规程》(第4 版) 规程[5]。

1.3.2 PCR 检测毒素基因 提取粪便样本中艰难梭菌DNA，参考文献[6-8]合成引物，扩增16S rDNA 基因、毒素基因tcdA 和tcdB、二元毒素基因cdtA 和cdtB，用琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.3 多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST) 参考文献[7]扩增adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpiA 7 个管家基因，外送测序，将结果与数据库比对，获得等位基因数，判断序列型(Sequence Type, ST)。用BioNumerics 7.6 软件作最小生成树图，进行进化分析。

1.3.4 研究对象临床信息采集 借助医院LIS 和HIS 平台收集研究对象个人信息(年龄、性别、糖尿病史等)和实验室信息(血常规、生化指标等)。

1.4 统计分析 应用stata 13 软件进行统计分析。正态分布数据采用独立样本 检验，以Mean±SD 表示；非正态分布数据采用非参数检验，以中位数和四分位间距(P25-P75) 表示；计数资料采用检验，以例数和百分比(n,%)表示。＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 老年Ⅱ型糖尿病住院患者艰难梭菌分离培养和鉴定情况 从264 份粪便样本中，培养出艰难梭菌52株，阳性率为19.70%。经PCR 检测毒素基因，1 株为非产毒艰难梭菌，51 株产毒，产毒基因携带率为98.08% (51/52)。其中毒素A 阴性、毒素B 阳性、二元毒素阴性(A-/B+/二元-) 菌株15 株(29.41%)，毒素A、B 阳性、二元毒素阴性(A+/B+/二元-) 菌株34 株(66.67%)，毒素A、B、二元毒素均为阳性(A+/B+/二元+) 菌株2 株(3.92%)。

2.2 51 株艰难梭菌分离株MLST 情况 对从老年Ⅱ型糖尿病患者样本中分离的艰难梭菌进行MLST，检出20 种ST，其中48 株为已知ST 菌株，分属于17 个不同ST，ST81 最常见，占23.53%，其他比较常见的是ST2 (19.61%)、ST3 (11.76%) 和ST54 (7.84%)，同时发现3 个新的、未被报道的ST 型，检出1 株ST37，未检出ST1。对其进行进化分析，ST81 与ST37亲缘关系较近，与其余ST 亲缘关系较远，具体见图1。

2.3 老年Ⅱ型糖尿病患者部分临床资料 与艰难梭菌未检出组相比，检出组住院时间偏长、外周血中性粒细胞计数和百分比偏高，C 反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、肌酐水平较高，淋巴细胞计数和百分比、白蛋白、前白蛋白水平较低，差异有统计学意义＜0.05)。两组年龄、性别构成、糖尿病病程、白细胞计数比较，差异无统计学意义＞0.05)，具体见表1。

3 讨论

正常成人艰难梭菌携带率为1%～7%[7]。本研究老年Ⅱ型糖尿病患者艰难梭菌阳性率为19.70%(52/264)，高于正常成人携带率。我们用PCR 检测毒素基因，阳性率为98.08%(51/52)，即检出艰难梭菌多为产毒株。毒素与肠上皮细胞受体相互作用，可导致细胞凋亡、炎性细胞浸润, 产生肠毒性和细胞毒性[9]。所以部分无症状携带者可在病情变化、抗菌药物暴露等情况下发生艰难梭菌感染，应引起医护人员警惕。

为了解艰难梭菌在老年Ⅱ型糖尿病患者中的分子流行病学特点，本研究进行了MLST，发现ST81 是最主要的型别，与Qin 等[10]的研究ST81 分离率最高，占30.8% (28/91) 相似，分析原因可能是该菌株高抗生素抗性，低毒力及老年糖尿病患者免疫功能低下。其他常见型别是ST2、ST3 和ST54，与Jin 等[11]对我国华东地区的研究结果一致。本研究未检出造成高病死率、高复发率的艰难梭菌ST1[12]，却检出1 株曾在亚太地区流行甚至暴发的ST37[13]，应引起重视。

本文比较老年Ⅱ型糖尿病患者的临床特点，发现检出组住院时间相对延长(＜0.05)，与上海瑞金医院研究结果相似，60 岁及以上艰难梭菌感染患者住院时间高于未感染患者[(1811) d，＜0.05][14]，提示携带艰难梭菌的老年Ⅱ型糖尿病患者可能健康状况受到影响，需引起关注。

表1 组间临床资料比较[Mean±SD，中位数(P25-P75)，n(%)]

美国医疗卫生流行病学会和美国传染病学会2017年临床实践指南指出：白细胞和血清肌酐水平升高可作为判断艰难梭菌感染严重程度的参考指标[2]，而本研究观察到两组白细胞总数差异无统计学意义(＞0.05)，但检出组白细胞分类中的中性粒细胞总数和百分率偏高，淋巴细胞计数和百分比偏低，且CRP增高有统计学意义(＜0.05)，提示老年Ⅱ型糖尿病艰难梭菌检出者，可能存在炎症反应，免疫力偏弱。

既往研究显示血清白蛋白水平与艰难梭菌检出有关[14]，本研究中也观察到白蛋白、前白蛋白水平相对较低(＜0.05)，提示可能肝细胞合成蛋白功能受影响。此外，检出组血清肌酐水平高于未检出组，差异有统计学意义(＜0.05)，提示可能肾小球滤过功能也受影响。即老年Ⅱ型糖尿病患者携带艰难梭菌，可能影响肝肾功能。

本院老年Ⅱ型糖尿病患者艰难梭菌检出率高、产毒株占比高。艰难梭菌检出组外周血中性粒细胞、CRP、肌酐水平偏高；淋巴细胞、白蛋白、前白蛋白水平偏低。当血液炎症及肝肾功能指标趋于异常时，建议对以上患者进行艰难梭菌筛查及毒素检测，以及早干预，降低风险。本研究存在一定局限性，如样本数量少，选择区域小，未进行药敏试验。下一步将联合其他多家医院进行更深入研究。