老年非小细胞肺癌患者血浆表皮生长因子受体突变状况的分析

姜文容，缪应新，王粟，丁立，王诗雯，赵虎，张艳梅

复旦大学附属华东医院检验科，上海200040

肺癌是目前临床最常见的恶性肿瘤之一，其中90%以上的病理类型为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]。近年来，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的突变已明确与NSCLC 的靶向治疗药物——EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的疗效密切相关[2]。目前，临床EGFR 突变检测首选组织样本[3]，但操作侵入性大、检测耗时，无法均化肿瘤异质性，尤其不适用于无法耐受侵入性取样及发生获得性耐药后需二次活检的老年患者。此时，循环肿瘤脱氧核糖核酸（circulating tumor deoxyribonucleic acid, ctDNA）可作为良好的替代检测靶标。ctDNA作为液体活检的热门标志物之一，是存在于血浆等体液中的、来源于肿瘤细胞的双链DNA 片段，且携带高特异的肿瘤标记，可用于患者全身肿瘤状况变化的动态监测[4-5]。近年来，血浆ctDNA EGFR 突变的检测已被广泛应用于临床NSCLC 患者EGFR-TKIs 靶向治疗的疗效评估，但其在老年NSCLC 患者中的突变状况尚未见报道。本研究通过分析老年NSCLC 患者血浆ctDNA 浓度及EGFR 突变状况与患者性别、年龄、吸烟史、靶向药物用药史等临床参数的相关性，旨在为老年患者的NSCLC 诊疗提供更准确的实验室依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年6月—2020年3月，于复旦大学附属华东医院就诊的老年NSCLC 患者84 例。纳入标准：（1）年龄≥60 岁；（2）符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南（2019 版）》[6]，且组织病理学确诊为NSCLC。排除标准：（1）伴有其他器官或组织原发肿瘤；（2）近2 周内曾接受放、化疗治疗；（3）伴有严重炎症。通过患者信息登记表及查阅电子病历收集患者的年龄、性别、吸烟史、靶向治疗史和疾病状态等临床资料。84 例老年NSCLC 患者年龄60～90 岁，平均（71.4±8.6）岁，其中男性42 例、女性42 例；有吸烟史23 例、无吸烟史61 例；未接受靶向治疗44例、接受一、二代EGFR-TKIs 靶向治疗＞1 个月40例；病情稳定32 例，肿瘤发生进展52 例。研究通过复旦大学附属华东医院伦理委员会审查（20160089）。

1.2 仪器与试剂NanoDrop One微量分光光度计和ABI 7500 实时荧光PCR 仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。核酸抽提试剂盒（AmoyDx离心柱型循环DNA 型核酸提取试剂）和EGFR 突变检测试剂盒（AmoyDxEGFR 基因T790M 突变检测试剂）购自厦门艾德生物医药有限公司。

1.3 检测方法 使用EDTA-K2采血管，采集研究对象空腹外周静脉血10 mL。每例样本2 000 g 离心10 min分离所有血浆；8 000 g 再次离心10 min 后，分离4 mL血浆，采用AmoyDx循环DNA 型核酸提取试剂（离心柱型）进行ctDNA 抽提。采用NanoDrop One 微量分光光度计检测抽提样本的ctDNA 浓度后，采用AmoyDxEGFR基因突变检测试剂进行EGFR突变的检测。完成反应混合液的配置及样本和对照品的加样后，使用ABI 7500 实时荧光PCR 仪进行检测。在对照品和各样本内控VIC 信号均判定合格的情况下，通过计算Ct 值（Ct 值= Ct 值FAM/ROX/CY5-Ct 值VIC）进行结果判定，若Ct 值小于某型别判定下限则为该型别突变型，反之则为野生型。共可检出7 类主要EGFR 突变类型，即：19del、L858R、T790M、20ins、G719X、L861Q 和S768I。

1.4 统计学方法 所有统计分析使用SPSS 22.0 统计软件。患者年龄为正态分布计量资料，以均数±标准差（±s）表示；ctDNA 浓度为偏态分布计量资料，以中位数（四分位间距）表示，采用秩和检验；EGFR 突变率及突变类型为计数资料，以例数表示，采用检验，＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆ctDNA 浓度及EGFR 突变率与老年NSCLC患者临床参数的相关性 84 例老年NSCLC 患者的血浆ctDNA 浓度为7.70（4.85,10.90）ng/L。不同年龄组的老年NSCLC 患者血浆ctDNA 浓度差异有统计学意义（=0.043），75～90 岁组患者血浆ctDNA 浓度较60～74 岁组更高。不同疾病状态组的血浆ctDNA 浓度也存在统计学差异（=0.008），肿瘤进展组患者的ctDNA 浓度高于病情稳定组。

表1 老年NSCLC 患者血浆ctDNA 浓度及EGFR 突变率与临床各参数的相关性

46 例患者为EGFR 突变型，EGFR 突变率为54.76%。老年NSCLC 患者血浆ctDNA 的EGFR 突变率与靶向治疗相关，未接受靶向治疗组患者的突变率低于靶向治疗组，差异有统计学意义（=0.002）。其余各临床参数分组的血浆ctDNA EGFR突变率均无统计学差异（＞0.05）。见表1。

2.2 血浆ctDNA EGFR 突变与老年NSCLC 患者临床参数的相关性84 例老年NSCLC患者中，携带EGFRTKIs 敏感突变的有35 例，敏感突变率为41.67%；携带耐药突变的有11 例，耐药突变率为13.10%。75～90岁、无吸烟史的女性NSCLC 患者携带敏感突变的比例更高；而60～74 岁、有吸烟史的男性NSCLC 患者携带耐药突变的比例更高。

在46 例突变型病例中，19 例检出19del、14 例检出L858R、10 例检出T790M、3 例检出其他EGFR突变型别。进一步分析发现，老年NSCLC 患者血浆ctDNA 的EGFR 突变与吸烟史（=0.046）、靶向治疗史（=0.023）和疾病状态（=0.016）均相关。接受靶向药物治疗组及疾病进展组患者的T790M 检出率高于未接受靶向治疗组及疾病稳定组。见表2。

3 讨论

目前，肺癌的发病率和病死率呈逐年上升趋势。由于其发病隐匿，缺乏有效的早期检测手段，约80%患者确诊时已属中晚期，并可伴有远端转移，致使其预后较差、生存率较低，已成为我国老年肿瘤患者主要的死亡原因[7]。

EGFR 是一种跨膜糖蛋白，属于受体型酪氨酸激酶，其活性与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关[8]。EGFR 的突变与EGFR-TKIs 的疗效密切相关。在亚裔NSCLC 患者中，EGFR 的突变率高达50%[9]，其中19 号外显子的缺失突变以及21 号外显子的L858R突变约占EGFR 突变总数的90%，与患者对EGFR-TKIs治疗的敏感性显著关联[10]。EGFR 20 号外显子的错义突变T790M 是最主要的EGFR-TKIs 治疗后获得性耐药突变[11]。通常接受一、二代EGFR-TKIs 治疗的患者会在治疗后的9～13 个月出现耐药，其中约50%的患者是由于T790M 突变所致[12]。

目前，组织活检是EGFR 检测的金标准，但其侵入性大、无法实时监测、且检测结果受样本采集影响大。而血浆ctDNA 的EGFR 突变检测仅需采集患者血液样本，创伤小；可实现多次重复采样，实时跟踪疾病的进展，尤其是发现继发性耐药；还能够克服肿瘤组织异质性的影响，尤其适用于无法通过再次手术或活检获取肿瘤组织的患者，已被广泛应用于临床肿瘤患者的辅助诊断[13-14]。ctDNA 的基因特性与原位肿瘤组织高度一致[15]，监测ctDNA 的EGFR 突变负荷变化能够在影像学变化前对患者进行疗效评估[16]，故血浆ctDNA EGFR 突变状况的连续监测在NSCLC 患者接受EGFR-TKIs 靶向治疗疗效评估方面具有重要的临床应用价值。当然，血液中的ctDNA 含量极少，因而对其检测方法的灵敏度要求也更高。

本研究发现，不同年龄组和不同疾病状态组的老年NSCLC 患者血浆ctDNA 浓度存在统计学差异。高年龄组的ctDNA 浓度高于低年龄组，其可能的原因为高年龄组患者体内的肿瘤负荷随着病程延长而逐步增加，导致ctDNA 释放增多。进展组的ctDNA 浓度高于稳定组，则可能是由于ctDNA 浓度与肿瘤的活动性相关，在肿瘤进展期ctDNA 的释放可增加[17]。通过对血浆ctDNA 的EGFR 突变检测发现，老年NSCLC 患者的EGFR 突变率为54.76%，略高于亚裔人群的普遍突变率（约50%）[9]，说明基于血浆ctDNA的EGFR 突变检测同样能为临床EGFR-TKIs 的使用提供参考依据。同时，研究结果显示老年NSCLC 患者的EGFR 突变率与其靶向治疗史有关，接受靶向治疗组患者的EGFR 突变率高于未接受靶向治疗组。考虑其可能的原因为：（1）未接受靶向治疗的患者通常是由于基础疾病等原因无法进行组织样本检测的群体，其EGFR 突变状况未知，突变率符合人群一般水平；（2）而接受靶向治疗的患者通常以确认EGFR 突变状况的改变和是否需要更换治疗手段为检测目的，多数已通过先期检测确定携带有EGFR-TKIs 敏感突变，在进行靶向治疗后、疾病发生进展时进行复检以确认是否出现获得性耐药突变，通常至少携带1 种突变，甚至可检出双重突变；（3）此外，化疗可导致EGFR 突变状况的改变[18]，故联合使用化疗的患者也需定期复检以保证靶向疗效。进一步对EGFR 突变状况进行分析发现，接受靶向治疗组和疾病进展组的T790M 检出率高于未接受靶向治疗组和疾病稳定组，与以往的研究结果一致[19]，也再次证实了T790M 为EGFRTKIs 最重要的获得性耐药突变位点，以及在靶向治疗过程中监测EGFR 突变的重要性。本次研究还发现老年NSCLC 患者血浆ctDNA EGFR 突变类型与吸烟史有关，与既往报道不一致[20]，其原因可能与入组患者数量和检测方法等因素有关。

表2 老年NSCLC 患者血浆ctDNA EGFR 突变与临床各参数的相关性

本研究综合分析了老年NSCLC 患者血浆ctDNA EGFR 突变状况与各临床参数间的相关性，发现不同年龄、疾病状态的老年NSCLC 患者血浆ctDNA 浓度存在差异；老年NSCLC 患者血浆ctDNA EGFR 突变率相对较高，并与靶向治疗史相关，且EGFR 突变状况也因靶向治疗史和疾病状态的不同而存在差异，证实了血浆ctDNA EGFR 突变检测在临床EGFR-TKIs治疗和疗效评估中的重要性。本研究也存在一定局限性，如病例数有限、未对患者进行靶向治疗前后的跟踪分析，尚无法全面评估血浆ctDNA EGFR 突变检测在动态监测中的应用，有待在未来工作中进一步完善。综上所述，血浆ctDNA EGFR 突变检测具有实时、无创和均质等优势，在临床实际诊疗中，应尽量获取患者全身肿瘤状况的动态变化，并结合具体临床参数，为临床老年NSCLC 患者提供更精准的诊疗服务。