聚苯乙烯纳米探针与丁二酮肟反应耦合共振瑞利散射-能量转移光谱法测定痕量尿素

姚东梅，卢珊珊，温桂清，梁爱惠，蒋治良*

1. 珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541004 2. 河池学院化学与生物工程学院，广西 宜州 546300

引 言

随着现代科技的不断进步，微纳米尺度的材料的发展越来越受到学术界的关注，人们也愈益认识到新型功能材料的重要性。聚苯乙烯纳米微球(PS)是一种易得的高分子材料，可通过乳液聚合、分散聚合、悬浮聚合、种子溶胀等方法来制备[1-3]。PS具有球形度好、比表面积大、骨架密度低、吸附性强、力学强度高、与不同极性的有机溶剂兼容性好等诸多优点，在荧光分析[4-5]，电化学检测[6-7]，细胞成像[8]等领域已有应用。Cui等[4]通过在PS磁珠上将大量量子点(QD)进行叠层组装，开发了一种基于QD的新扩增荧光标签，用于双DNA目标检测。该方法灵敏度高，但是需要进行标记，操作较复杂。Wang等[7]基于多层CdS量子点功能化PS作为生物探针和氧化石墨烯-聚苯胺复合材料的信号放大策略，开发了一种新型的超灵敏电化学生物传感器，用于10～1.0×107/mL-1K562细胞的检测。该方法具有很高的特异性和灵敏度。Qu等[8]制备了聚乙二醇(PEG)接枝的聚苯乙烯微球，基于Fe3+在细胞质中的选择性荧光猝灭作用，可用于细胞内Fe3+的成像。该方法中PS具有良好的生物相容性和可忽略的细胞毒性，但是实验成本较高。据我们所知，尚未发现PS探针用于共振瑞利散射(RRS)光谱分析，因此，研究PS在RRS分析中的应用具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-7000荧光光谱仪(Hitachi Co. Ltd)；TU-1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；FEI Quanta 200场发射环境扫描电子显微镜(Thermo Fisher, USA)；HH-S2电热恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；SK3300超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

聚苯乙烯纳米微粒(Polystyrene nanoparticles，PS)采用乳液聚合制备, 其粒径为 (50.0～100 nm，Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd)。0.25 mg·mL-1聚苯乙烯纳米微粒溶液制备：因该微球不能直接溶入水，但可采用以下方法制备其水溶液。准确称取12.5 mg聚苯乙烯纳米微粒于20 mL甲苯中，溶解完全后加入50 mL水，超声至甲苯全部挥发完，溶液呈深乳白色，即得到0.25 mg·mL-1聚苯乙烯纳米微粒溶液。1 mg·mL-1尿素(UR)储备液：准确称取0.1 g UR溶于二次水中，定容到100 mL容量瓶中得到16.65 mmol·L-1UR标准液，使用时逐级稀释；6 mol·L-1HCl溶液：取5 mL 12 mol·L-1HCl于干净的10 mL量筒中加入5 mL二次蒸馏水；3%丁二酮肟(DMG)：0.18 g DMG溶解于6 mL 6 mol·L-1的HCl中得到3% DMG溶液，现配现用；2.2×10-2mol·L-1胺基硫脲(TSC)：0.200 4 g TSC溶于100 mL二次水中得到2.2×10-2mol·L-1TSC溶液备用。所用试剂均为分析纯级，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

准确吸取一定量40 μg·mL-1UR溶液于试管中，加入250 μL 6 mol·L-1HCl溶液，20 μL 2.2×10-2mol·L-1TSC，150 μL 3% DMG，摇匀，置80 ℃水浴中加热20 min，冷却后，加入140 μL 0.25 mg·mL-1聚苯乙烯纳米微粒，用二次蒸馏水定容至2 mL，静置8 min。用日立F-7000荧光光谱仪(电压350 V，狭缝5 nm)获得溶液在200～700 nm的共振瑞利散射光谱，记录500 nm处的RRS强度(I)，以不加UR作空白记录空白强度(I0)，并计算ΔI=I0-I。

2 结果与讨论

在酸性条件下，丁二酮肟在水溶液中首先反应生成中间产物双乙酰，双乙酰进一步与尿素在稳定剂TSC的作用下共热生成稳定的红色二嗪衍生物DIK，作为RRS供体的PS与受体DIK之间发生共振瑞利散射能量转移，随着UR浓度的增加，生成的红色产物DIK越多，共振瑞利散射能量转移现象越明显，体系在500 nm处的RRS信号强度线性降低，并且在一定范围内，RRS信号降低值与UR浓度成线性关系，据此可建立检测UR的RRS-ET分析方法。

2.1 RRS和吸收光谱

在强酸及80 ℃水浴中，研究了PS体系的RRS光谱。该体系在400及500 nm处分别有一个RRS峰，500 nm处RRS信号随着UR浓度增大逐渐降低(图1)，主要是由于随着UR的浓度增大，生成的DIK越来越多，RRS-ET现象越来越明显的原因。紫外吸收光谱表明，分析体系在530 nm处有吸收峰，且随着UR浓度的增大，体系的吸光度逐渐增大，是因为生成的DIK越来越多。

图1 UR-DMG-PS体系的RRS光谱

2.2 聚苯乙烯微球的表征

PS在375及500 nm处分别有一个RRS峰，随着RRS浓度的增大，其在375及500 nm处的RRS信号逐渐上升。375 nm处的RRS峰不发生共振能量转移，500 nm处谱峰与DIK之间发生共振能量转移。PS的吸收峰出现在310～330 nm处左右，随着浓度增大，吸收信号逐渐增大，波长发生微小红移，可能与其浓度有关。

按照实验方法制备样品，取2 μL样品溶液滴到硅片表面，自然晾干后用扫描电子显微镜记录样品形貌，从图2可知，聚苯乙烯微球呈球形结构，颗粒粒度不够均匀，平均粒径为63 nm。

图2 聚苯乙烯纳米微粒的扫描电镜图像Fig.2 Scanning electron microscope image of PS

2.3 分析优化条件

对影响测定的试剂浓度进行研究。结果表明，当HCl溶液浓度为0.75 mol·L-1，TSC溶液浓度为0.22 mmol·L-1，DMG溶液浓度为19.35 mmol·L-1，聚苯乙烯纳米微粒的浓度为17.5 μg·mL-1水浴温度为80 ℃，水浴反应时间为20 min时，体系ΔI最大。因此，选择以上条件作为反应最佳条件。

2.4 工作曲线

按照实验结果绘制了体系的工作曲线。对于UR-DMG-PS体系，在一定范围内，随着UR浓度的增大，体系的ΔI值逐渐增大，尿素浓度在2.0～3 200 ng·mL-1范围内与共振瑞利散射信号降低值ΔI呈良好的线性关系(图1)，线性方程为ΔI=0.327c+108.8，线性相关系数为0.9764，检出限2.0 ng·mL-1。与已报道的方法比较(表1)，本方法操作简便、灵敏度高，是一种快速检测UR的新方法。

表1 测定尿素的分析方法的比较Table 1 Comparison of analytical methods for detecting UR

2.5 干扰离子的影响

2.6 样品测定

取某人不同时间段A，B和C的三种尿液，分别稀释100倍后得到样品储备液，然后取10 μL样品储备液按照实验方法测定。其含量分别为179.1，282.3和466.3 μg·mL-1尿素，样品加标回收率在94.19%～96.94%之间，RSD在4.20%～6.35%之间。

3 结 论

利用PS在超声条件下溶解于甲苯中得到乳白色悬浮液作为共振瑞利散射能量的供体。在强酸及稳定剂氨基硫脲存在条件下，丁二酮肟与尿素共热生成稳定的红色二嗪衍生物4，5-二甲基-2-咪唑酮与聚苯乙烯纳米微粒结合发生RRS-ET效应，据此建立了RRS-ET分析尿素的新方法，方法操作简单、灵敏度高、选择性好等特点。