轮作和有机肥对滨海灰潮土土壤微生物种群的影响

陈余平，郑华章，周飞，胡铁军

(余姚市农业技术推广服务总站，浙江 余姚 315400)

微生物是土壤生态系统中最活跃的组成部分，是土壤养分循环的重要驱动力。土壤微生物群落结构、生物量等可以反映土壤质量与土壤肥力的演变趋势，常被用作评价土壤健康的重要指标[1]。土壤微生物，特别是细菌群落的多样性在土壤生态系统营养元素的循环、植物病虫害防治，及土壤肥力的保持等方面发挥着重要的作用。耕作方式和作物类型的变化均会改变土壤微生物群落特征[2]，因此，选择合理的栽培措施，调节土壤微生物群落组成是保障现代农业稳产高产和作物安全的重要举措之一。施肥会直接或间接地改变农田生态系统的养分平衡与供应状况，进而影响土壤的物理、化学、生物学特性。研究发现，施用有机物料能显著提高土壤微生物量和菌群数，但对不同菌群的影响程度有所差异[3-4]。从生产实践上看，明确不同种植制度、土地利用状况，以及特定土壤类型下施用有机肥对土壤生物学性状的影响，对于农田土壤培肥、养分资源的高效利用等均具有现实意义。针对浙江省滨海围涂区域的种植结构和施肥现状，以余姚市滨海灰潮土为研究对象，设计连续3 a的定位试验，引入生物高通量测序技术，考查不同轮作和施用有机肥处理条件下土壤微生物种群的变化情况，以期为农业种植结构调整、土壤地力培肥提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 试验概况

试验在余姚市小曹娥镇佳云西兰花专业合作社进行。试验地块属于典型的加工蔬菜种植区，供试土壤为滨海灰潮土，进行连续3 a的包含轮作和施用有机肥处理的大田裂区试验。各处理的轮作方式和有机肥施用情况简述如下：T1，春、秋、冬均种植绿花菜，不施用商品有机肥；T2，春绿花菜-单季晚稻，年商品有机肥施用量7 500 kg·hm-2；T3，春绿花菜-单季晚稻，不施用商品有机肥；T4，冬绿花菜-早稻，年商品有机肥施用量7 500 kg·hm-2；T5，冬绿花菜-早稻，不施用商品有机肥；T6，冬绿花菜-菜用大豆，不施用商品有机肥；T7，雪菜-四季豆-单季晚稻，年商品有机肥施用量7 500 kg·hm-2；T8，雪菜-四季豆-单季晚稻，不施用商品有机肥；T9，雪菜-四季豆-夏玉米，不施用商品有机肥。

1.2 样品采集

试验共进行3 a，于2019年11月中旬最后一茬作物收获后采集土壤样品。各小区以“S”形8点采集耕层土壤，混为一个土样，用冰盒保存，并迅速带回实验室。剔去植物根系、可见动物残体和石粒等，均匀混合，平铺，取5点，放入样品试管中。每个土壤样品取样3～5 g，然后由上海美吉生物医药科技有限公司进行土壤微生物群落多样性测序和交互式分析。

1.3 测定方法

土壤细菌群落由16S rRNA测序，引物为338F_806R；真菌由18S rRNA测序，引物为ITS1F_ITS2R。完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的DNA基因组纯度。PCR扩增，采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfuDNA Polymerase试剂盒，20 μL反应体系，在ABI GeneAmp®9700型PCR仪上进行。采用Miseq测序系统测序。

1.4 数据统计

利用Usearch (version 7.1)软件，将测序分析结果聚类为用于物种分类的OTU(操作分类单元)，并对所有样品进行抽平。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，将置信度阈值设为0.7，选用Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)数据库得到分类学信息。利用Mothur(version 1.31.2)软件进行α多样性分析，经Rank-Abundance曲线分析，证实物种丰富度和群落均匀度符合要求。经群落组分析，得相对丰度。利用FUNGuild预测分析真菌物种功能性。

2 结果与分析

2.1 轮作对滨海灰潮土土壤微生物种群的影响

经连续3 a的旱旱、水旱轮作后，基于土壤样品检测分析数据，具体考查T1和T3(第1组)、T6和T5(第2组)、T9和T8(第3组)等3组轮作方式下滨海灰潮土土壤微生物种群的变化情况。

2.1.1 多样性分析

细菌、真菌的丰富度实际观测值(Sobs值)代表土壤样本中微生物物种的丰富程度，也可理解为微生物物种的数量。经Miseq测序、α多样性分析，3 a轮作后试验各处理细菌、真菌的Sobs值变化情况如表1所示。可以看出：经连续3 a水旱轮作(T3、T5、T8)后，相应组别下土壤微生物中的细菌物种要比旱旱轮作(T1、T6、T9)的丰富，高出5.90%～16.16%。对于真菌而言，除T1与T3处理的Sobs值相近外，其余2组也同样表现为水旱轮作后土壤微生物中的真菌物种要比旱旱轮作后的丰富。这是因为水旱轮作模式下淹水状态的微生物总数、细菌、放线菌数量高于湿润状态[5]。试验结果表明，水旱轮作比旱旱轮作有利于丰富土壤微生物的物种多样性，有助于增加土壤的微生物量碳、氮，进而提高土壤肥力。

表1 轮作条件下滨海灰潮土土壤细菌、 真菌的Sobs值

2.1.2 群落组成分析

在门分类学水平上统计各样本的物种丰度。经3 a连续轮作后检测分析采集的土壤样品，保留累计丰度在97%以上的群落组成，得到18个门的细菌种群和11个门的真菌种群。各处理18个门细菌种群的丰度变化如图1所示：第1～3组中，水旱轮作后土壤中的绿屈挠菌门、蓝细菌门、Patescibacteria、WS2丰度较旱旱轮作下增加，放线菌门、厚壁菌门、Rokubacteria丰度下降(降幅3.28%～46.19%)。各处理11个门真菌种群的丰度变化如图2所示：从旱旱轮作改为水旱轮作后，所有组别相应土壤的丝孢菌门丰度均下降(降幅6.88%～75.27%)；在第1组和第3组中，从旱旱轮作改为水旱轮作后，隐真菌门、丝足虫类和未经分类的真菌丰度值均增加，而子囊菌门、担子菌门的丰度值下降。

图1 轮作条件下滨海潮土的细菌丰度

图2 轮作条件下滨海潮土的真菌丰度

不同的轮作方式，会导致土壤微生物种群比例发生变化。土壤微生物种群丰度值上升，说明这种轮作方式适宜于该种群的生长，反之则不利于该种群的生长。水旱轮作转换过程中水分的变化可调控土壤中某些细菌种群的数量，特别是能促进较适应恶劣环境的光异养细菌的生长，但对好氧的细菌和腐生菌却有抑制作用。水旱轮作对真菌(被孢霉门除外)的影响不尽一致。本研究3组处理中水稻的种植季节不同：1个是种早稻，另外2个是种单季晚稻。对比3组处理中早稻与晚稻季门水平上细菌与真菌的丰度变化，发现细菌丰度变化表现一致的数量要多于真菌，这说明真菌对土壤水分变化的敏感性要高于细菌。

2.1.3 真菌的FunGuild功能分类统计

FunGuild基于目前已发表的文献或权威网站数据库，根据营养方式将真菌分为病理营养型、共生营养型与腐生营养型3大类。如表2所示，旱旱轮作改为水旱轮作后，病理营养型土壤真菌数量显著降低，共生营养型真菌数量有所下降，而腐生营养型真菌数量明显上升。这说明水旱轮作在一定程度上有助于减少农作物病虫害。

表2 轮作条件下滨海灰潮土土壤真菌 FunGuild分类

2.2 施用有机肥对滨海灰潮土土壤微生物种群的影响

在旱旱或水旱轮作一致情况下，分析连续3 a施用商品有机肥(T2、T4、T7)和不施用有机肥(T3、T5、T8)对滨海灰潮土土壤微生物种群的影响。以T2和T3对比作为第4组，T4和T5对比作为第5组，T7和T8对比作为第6组。

2.2.1 多样性分析

经Miseq测序、α多样性分析，各处理细菌、真菌的Sobs值如表3所示。可以看出，连续3 a施用有机肥处理的土壤中细菌物种更丰富。对于真菌而言，除第6组外，施用有机肥处理的土壤中真菌物种也更丰富。这说明施用有机肥有利于增加土壤中微生物的多样性。

表3 施用有机肥对滨海灰潮土土壤细菌、 真菌sobs值的影响

2.2.2 群落组成分析

经3 a连续不同施肥处理后，检测分析采集的土壤样品，保留累计丰度在97%以上的群落组成，得到18个门的细菌种群和11个门的真菌种群。各处理18个门类细菌种群的丰度变化如图3所示：连续施用有机肥后，土壤中的厚壁菌门、Entotheonellaeota丰度增加(增幅1.25%～67.47%)，酸杆菌门、疣微菌门、WS2丰度下降(降幅1.72%～584%)。各处理11个门类真菌种群的丰度变化如图4所示：连续施用有机肥后，土壤中的子囊菌门、担子菌门、丝孢菌门丰度增加(增幅0.66%～521.16%)，油壶菌门和未经分类的真菌丰度下降(降幅3.16%～39.31%)。

图3 施用有机肥对滨海灰潮土细菌丰度的影响

图4 施用有机肥对滨海灰潮土真菌丰度的影响

可以看出，施用有机肥并不是对所有微生物都是有利的。虽然有机肥为土壤微生物提供了丰富的营养，但是在土壤环境的局限下土壤微生物之间存在竞争，有机肥的施用更有利于腐生型微生物的繁殖[6]，而对于寄生型微生物则会起到抑制作用。

2.2.3 真菌的FunGuild功能分类统计

对各组处理真菌的OTU检测值在FunGuild上进行检索分析，结果如表4所示。连续3 a施用有机肥后，各处理土壤中3类营养型的真菌OTU数值变化并不一致，从总体趋势上看，施用有机肥更有利于腐生营养型真菌的生长，其次是共生营养型，再次为病理营养型。因此，连续多年施用有机肥料，既有利于各类营养型真菌的富集，但也存在加剧土传病害的风险。

表4 施用有机肥对滨海灰潮土土壤 真菌FunGuild分类的影响

3 小结与讨论

水旱轮作与施用商品有机肥均能增加土壤微生物物种的丰富度，也能引起土壤微生物菌群结构的变化。本研究基于3 a定位试验，通过微生物高通量测序技术初步明确了余姚市滨海灰潮土土壤微生物种群群落结构变化。试验结果表明，轮作和施用有机肥均增加了土壤中细菌、真菌的丰度。在轮作条件下，真菌种群变化较细菌更多。在轮作时要关注土壤水分变化，在水旱轮作与旱旱轮作的比较中，土壤水分变化不仅影响光异养型细菌生长，还对好氧细菌和腐生型细菌有抑制作用。真菌较细菌对水分的变化更敏感。水旱轮作条件下：当种植水稻时，腐生营养型真菌增加，而共生营养型真菌被抑制；当种植旱地作物时，情况则迅速改变。此外，连续多年施用商品有机肥有利于腐生型微生物的繁殖生长。