荧光定量PCR与抗酸特殊染色对疑似骨关节结核中结核分枝杆菌的检测对比

孙林雍，严嘉琦，陈 昶，陈 昱，邹 艳，陈 杰，唐 源

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性传染性疾病，病原菌为MTB复合群，包括：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等[1]，可侵犯人体全身各种器官，以肺部最常见。骨关节结核是一种罕见的肺外结核病，早期症状不明显，近年来发病率呈上升趋势，尤其在不发达国家。我国是全球22个结核病高负担国之一，患病人数位居世界第2[2]，因此结核病成为制约我国社会经济发展的重大公共问题之一[3]。骨关节结核病灶中结核分枝杆菌比肺结核病灶中少，增加了早期诊断的难度。且此类结核通常进程缓慢，早期正确诊断和尽早适当治疗对骨关节结核的预后至关重要。本实验同时行实时荧光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)及抗酸染色检测，并与临床诊断结果进行比较，分析两种检测方法的灵敏度、特异性差异，以及MTB检出率与临床诊断符合率的一致性。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取四川大学华西医院2017年1月～2018年1月临床送检疑似骨关节结核样本253例。所有样本均经石蜡包埋组织切片，镜下形态学以肉芽肿性炎伴坏死部分区域可见钙化为主要组织学改变(图1)；对所有标本同时行RT-PCR及抗酸染色检测。

①②

1.2 仪器与试剂QIAamp DNA Tissue Kit(Cat.56404)、MTB核酸检测试剂盒(凯杰生物公司)、组织切片抗酸染色试剂盒(Ventana AFB Ⅲ Staining Kit，Roche公司)、Qiacube全自动组织处理机(Qiagen公司)、CFX-96 real-time PCR仪(Bio-Rad公司)、BenchMark全自动特殊染色机(罗氏诊断产品上海公司)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 取石蜡包埋组织切成5 μm厚切片3～5张装入EP管中用于DNA提取。操作步骤按照QIAamp(Cat.56404)DNA FFPE Tissue Kit(50 T)试剂盒说明书进行。

1.3.2抗酸染色 将石蜡包埋组织5 μm厚切片，裱片，烤片，打印相应条码贴于载玻片一侧，将玻片放置于BenchMark全自动特殊染色机，选择抗酸染色程序，进行自动染色，染色结束后封固盖玻片。

1.3.3RT-PCR 按产品说明配置反应体系，除待测样本外，同时进行阴性、阳性对照实验,阴、阳对照为试剂盒自带。将PCR反应管放入CFX-96 real-time PCR检测分析仪。PCR反应条件：37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，同时实施信号采集，返回第三步循环41次，结束反应。

1.3.4结果判读 抗酸染色切片油镜下见棕红色两端钝圆稍弯曲的细丝状杆菌判定为阳性，否则为阴性。RT-PCR按MTB核酸检测试剂盒产品说明，阴性对照Ct值=0，阳性对照Ct值<25，检测样本Ct值=0或>37判定为阴性，Ct值≤37判定为阳性。本实验将临床资料(结核菌素实验、结核菌培养等)综合诊断并经抗结核治疗的病例归类为结核，临床资料未诊断为结核的病例归类为非结核。

1.4 统计学方法各组检测结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，两组间比较采用四格表χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征253例样本中，男性127例，占50.2%，女性126例，占49.8%，男女比约1 ∶1。患者年龄1～82岁,中位年龄44岁。病变部位：脊椎139例、膝关节34例、髋关节22例、肋骨14例、腕关节9例、其他35例。

2.2 RT-PCR及抗酸染色检测结果与临床结果比较253例样本中，总检出率为45.8%(116/253)；其中，RT-PCR检出率为38.3%(97/253)，抗酸染色检出率为41.5%(105/253)，两种检测的符合率为88.1%(223/253)(表1，图2、3)。在116例阳性病例中，仅RT-PCR检测阳性11例，临床确诊9例，临床符合率为81.8%(9/11)；仅抗酸染色检测阳性19例，临床确诊5例，临床符合率为26.3%(5/19)；两种检测均阳性86例，临床确诊80例，临床符合率为93.0%(80/86)。两种检测均阳性比仅抗酸染色阳性与临床结果符合率的差异有统计学意义(χ2=44.910，P<0.001)；仅RT-PCR阳性比仅抗酸染色阳性与临床结果符合率的差异有统计学意义(χ2=8.623，P=0.003)；仅RT-PCR阳性比两种检测均阳性与临床符合率的差异无统计学意义(χ2=1.618，P=0.203)。本组样本中脱钙组织5例，其中3例临床确诊为结核病，2例临床确诊为非结核病。

表1 RT-PCR和抗酸染色法检测结果比较

图3 实时荧光定量PCR结果阳性，扩增曲线升起，CT值<37，阴、阳对照正常

2.3 灵敏度及特异性99例临床确诊为结核病样本中，RT-PCR检测89例阳性，10例阴性，灵敏度为89.9%(89/99)；抗酸染色检测85例阳性，14例阴性，灵敏度为85.9%(85/99)。154例临床确诊为非结核病样本中，RT-PCR检测8例阳性，146例阴性，特异性为94.8%(146/154)；抗酸染色检测20例阳性，134例阴性，特异性为87.0%(134/154)(表2)。

表2 RT-PCR和抗酸染色法检测骨关节组织中结核分枝杆菌的灵敏度和特异性比较

3 讨论

本实验中RT-PCR检出率为38.3%(97/253)，抗酸染色检出率为41.5%(105/253)。国内关于结核杆菌检出的报道中，姚梅宏等[4]对40例确诊结核病的石蜡包埋组织样本进行MTB检测，PCR及抗酸染色法的检出率分别为80%(32/40)、50%(20/40)，均高于本实验结果。本组为可疑骨关节结核病的石蜡包埋组织样本，报道选取确诊结核病的不限于骨关节的石蜡包埋组织样本。分析原因可能与样本选取有关。吴启秋等[5]对250例复治骨关节结核病经BACTEC法初代分离培养进行检测，检出率为18.4%(46/250)，明显低于本实验中骨关节结核病RT-PCR的检出率，其原因可能与检测方法及研究样本制备方法不同有关。李小燕等[6]对110例石蜡包埋组织样本行RT-PCR及抗酸染色检测，检出率分别为36.4%(40/110)、17.3%(19/110)。其RT-PCR的检出率与本实验结果基本一致，但抗酸染色的检出率明显低于本组结果，其原因可能与不同实验室抗酸染色质量、诊断医师镜下观察经验有关。

国内一组研究报道[7]不限于骨结核的肉芽肿性炎伴坏死，RT-PCR的检出率高于抗酸染色，而本组中RT-PCR的检出率略低于抗酸染色。分析原因可能与活检小标本组织过小，导致PCR检测组织中没有病变组织；以及骨组织、脱钙组织对PCR扩增的影响有关。本组两种检测的符合率为88.1%，林晓[8]对118例疑似结核病样本进行检测，两种检测的符合率为95.76%。分析本组病例符合率低于报道的原因，可能与选取样本及样本量有关。

本组19例抗酸染色阳性而RT-PCR检测阴性病例中，临床确诊为MTB(5例)的数量低于为非MTB(14例)。其原因可能与我院地处西南，病例构成来自多民族地区且人员流动复杂，容易造成其他抗酸阳性分枝杆菌感染有关。11例仅RT-PCR阳性病例中，临床确诊为MTB 9例、非MTB 2例。86例抗酸染色与RT-PCR均阳性病例中，临床确诊为MTB 80例、非MTB 6例。其中临床确诊为非MTB(8例)的病例均未经抗结核治疗，分析原因可能与骨关节结核发展缓慢，临床特征不明显有关。由于RT-PCR为结核病的特异性检测，因此当RT-PCR检测阳性临床诊断为非MTB时建议患者随访。本组样本中脱钙组织5例，临床确诊为结核病3例，其中2例抗酸染色及RT-PCR检测均为阴性；1例抗酸染色阳性，RT-PCR检测阴性。临床确诊为非结核病2例，抗酸染色及RT-PCR检测均为阴性。说明脱钙组织可能对抗酸染色及PCR扩增有影响。

本实验中RT-PCR检测试剂盒采用一对PCR引物和一个荧光双标记探针，中期扩增片段为IS6110，特异性通过了NMPA认证，检测灵敏度为每毫升10个MTB即可检出。尽管全自动抗酸染色与手工染色比较，染色条件恒定不受外界环境变化的影响，但由于抗酸染色阳性包括了MTB复合群、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌，不能区分MTB与非MTB，并受观察者主观因素影响，易造成漏、误诊[9]。因此，同时行RT-PCR及抗酸染色检测可以提高诊断结核病的准确性。

综上所述，本实验对比了疑似骨关节结核石蜡包埋组织RT-PCR和抗酸染色结果与临床结果发现，仅抗酸染色阳性时，因不能排除其他分枝杆菌感染，建议结合临床考虑；当RT-PCR检测阳性临床诊断为非MTB时，建议患者随访。