非小细胞肺癌驱动基因突变与临床病理特征的关系

眭玉霞，邓晓宇，伍 铮，林雅婷，张润民，郝昌鹏，陈灵锋，王丽萍，晋 龙

肺癌的发病率与病死率居恶性肿瘤之首，遗传学上具有较高的异质性[1]。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的80%～85%[2]。虽然临床治疗在传统手术和放、化疗联合治疗上已有很大改进，但总体疗效不佳，预后较差[3]。近十年来随着肿瘤分子生物学的发展和驱动基因研究的逐步深入，NSCLC的诊断和治疗发生了重大变革。多项研究表明，针对驱动基因的靶向治疗在晚期NSCLC患者的治疗和预后方面产生了革命性的影响，驱动基因是靶向治疗疗效的重要预测因子。本实验拟通过分析NSCLC中驱动基因(EGFR、KRAS、PIK3CA、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、HER-2和MET)的突变及与临床病理特征的相关性，旨在为推动多基因联合检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本 选取福建省立医院2013年4月～2017年1月收治的病理资料完整的550例原发性NSCLC作为研究对象。标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片及HE染色，由2名高年资病理医师采用双盲法进行重新审阅，依据WHO(2015)肺肿瘤组织学分类标准进行病理分型，并确定有足够的肿瘤细胞再进行后续检测。

1.1.2仪器与试剂 实验仪器采用安捷伦科技公司的荧光定量PCR仪(Mx3000P美国)、Illumina NextSeq 500。福尔马林固定石蜡包埋样本DNA/RNA共分离试剂盒及人类EGRF、KRAS、PIK3CA、ALK、RET、ROS1、NRAS、BRAF、HER-2和MET突变基因检测试剂、人类癌症多基因突变联合试剂盒(可逆末端终止测序法)均由厦门艾德生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1组织DNA和RNA的提取 用二甲苯及75%乙醇擦拭刀片、切片机刀座、镊子，保证无交叉污染，切取3张5 μm厚石蜡包埋组织样品，置于1.5 mL EP管内，二甲苯脱蜡后用甲醇固定石蜡包埋样本DNA/RNA共分离试剂盒提取基因组DNA和细胞总RNA。DNA和RNA分离完毕后，使用Nanodrop 2000测定DNA和RNA的浓度，DNA和RNA的A260/A280均介于1.8～2.1之间。

1.2.2蝎形探针扩增阻滞突变系统荧光定量PCR 使用厦门艾德生物公司的测试实际盒，根据试剂盒说明书进行操作。PCR反应条件：第一阶段42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，1个循环；第二阶段95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10个循环；第三阶段93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，36个循环。信号收集：第三阶段60 ℃时收集FAM和HEX信号，执行实时PCR。

1.2.3二代测序法 采用艾德生物公司的人类癌症多基因突变联合检测试剂盒(可逆末端终止测序法)，根据试剂盒说明操作：文库建构(打断、片段筛选、末端修复、接头连接、接头连接后纯化、文库扩增、文库纯化、文库质控)、杂交捕获(试剂准备、蒸干、杂交、捕获、洗涤、扩增产物捕获、扩增后纯化、捕获产物质控)、NextSeq上机、使用厦门艾德人类癌症多基因突变联合检测数据分析系统对检测数据进行分析。阳性判断值：平均原始深度应大于10 000×，平均有效深度大于500×，突变比例不低于0.4%，突变绝对拷贝数不低于2，链平衡性介于0.1～10之间，同时满足以上条件时判断为阳性。

1.2.4整理病理资料 将所有患者的病理资料进行分类整理，包括一般情况(年龄、性别、吸烟史)和临床病理(病理组织学类型、位置分型、临床分期、淋巴结转移)。

1.3 统计学分析应用SPSS 22.00软件进行统计学分析，采用χ2检验或Fisher精确概率法分析基因突变与临床病理特征的关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特点550例原发性NSCLC中，患者年龄23～89岁，中位年龄62岁，平均61岁。男性295例，女性255例，男女比为1.16 ∶1。驱动基因突变总发生率为73.6%(405/550)，分别为EGFR 57.3%(315/550)、KRAS 5.8%(32/550)、PIK3CA 2.2%(12/550)、ALK 3.8%(21/550)、RET 2.0%(11/550)、ROS1 1.1%(6/550)、NRAS 0.2%(1/550)、BRAF 1.5%(8/550)、HER-2 2.0%(11/550)和MET 0.3%(1/366)(图1)。腺癌(P<0.001)、女性(P<0.001)、非吸烟史(P<0.001)、位置亚型为周围型(P<0.001)以及形态学亚型以腺泡型为主(P=0.021)的腺癌患者较易发生驱动基因突变(表1)。

图1 肺癌驱动基因突变分布

2.2 联合突变特点本实验共发现12例联合突变患者及8例EGFR双位点突变患者，突变率分别为2.2%(12/550)和1.5%(8/550)。在联合突变中有11例合并EGFR突变，分别为EGFR与PIK3CA联合突变6例，EGFR与KRAS联合突变2例，EGFR与KRAS和PIK3CA三基因联合突变1例，EGFR与ROS1联合突变和EGFR与BRAF联合突变各1例。还有1例为RET与HER-2联合突变。本实验统计EFGR与PIK3CA联合突变样本，发现该联合突变更易发生在临床分期较高(P=0.034)的患者中，且有1例为胎儿型腺癌。在EGFR双位点突变的统计中显示，EGFR双位点突变多发于以乳头型为主的腺癌(P=0.005)和有淋巴结转移(P=0.022)者中(表1)。

2.3 NSCLC中EGFR突变与临床病理特征的关系EGFR突变更容易发生在女性(P<0.001)、无吸烟史(P<0.001)、腺癌(P<0.001)、周围型(P<0.001)和以腺泡型为主的腺癌患者中(P=0.048)，少见于以实体型和黏液型为主的腺癌(P<0.001，表1)。

表1 NSCLC中驱动基因总突变、EGFR突变、联合PIK3CA突变及EGFR双位点突变与临床病理特征的关系

2.4 NSCLC中KRAS突变与临床病理特征的关系KRAS突变易发生于有吸烟史(P=0.006)的男性(P=0.043)患者。KRAS突变率在以浸润黏液型为主的腺癌中更高(P=0.008),而不易发生在以贴壁型为主的腺癌患者中(P=0.010，表2)。

2.5 NSCLC中PIK3CA突变与临床病理特征的关系在PIK3CA突变患者中男性患者的突变率比女性更高(P=0.042)；与其他病理特征无明显相关性(表2)。

2.6 NSCLC中ALK、RET和ROS1融合基因突变与临床病理特征的关系在550例NSCLC中，融合基因总阳性检出率为6.9%(38/550)，其中ALK突变较容易发生在以实体型为主的腺癌(P=0.035)和有淋巴结转移(P=0.008)的患者中，贴壁型腺癌患者不易发生此基因突变(P=0.034)。ALK在<62岁的患者较多(P=0.117),但差异无统计学意义。RET阳性率为2.0%(11/550)，也较容易发生在以实体型为主(P=0.030)的腺癌中(表2)。ROS1阳性率为1.1%(6/550)，统计结果显示其与临床病理均无明显相关性。

表2 NSCLC中KRAS、PIK3CA、ALK、RET基因突变与临床病理特征的关系

2.7 NSCLC中NRAS、BRAF、HER-2、MET突变与临床病理特征的关系在550例NSCLC中有NRAS、BRAF、HER-2、MET基因突变患者均为腺癌、非吸烟且位置分型为周围型的患者，多有淋巴结转移，但其差异均无统计学意义。

3 讨论

在过去10年间，有关NSCLC驱动基因的研究取得了明显进步，尤其在肺腺癌中约60%的驱动基因被确定，肺鳞癌驱动基因的检出率也在逐步提高[4]。本实验结果显示，NSCLC常见的10种驱动基因总突变率为73.6%。驱动基因突变易发生在腺癌、女性、不吸烟且组织学形态以腺泡型为主的患者中，与既往研究报道一致[5]。

本实验中EGFR突变率为57.3%，在所有驱动基因中占比最高，与国外报道较一致[6]。EGFR基因突变多见于女性、非吸烟及周围型的肺腺癌患者，而与年龄及肿瘤分期无关。这与本组前期报道[7]结果相一致。根据中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南(2018)的相关建议，所有含腺癌成分的NSCLC，无论其临床特征，应常规行EGFR突变/ALK融合突变检测[8]。在组织学亚型的相关性研究中，EGFR在以腺泡型为主型的肺腺癌中较易发生突变，而在以黏液型和实体型为主型的肺腺癌中较少见，这与本组前期的研究[9]结论一致。

本组中KRAS基因突变率为5.8%，全部为肺腺癌患者，KRAS基因突变与吸烟史密切相关，男性突变率高于女性，与黄清洁等[10]研究相符。KRAS基因突变易发生于以黏液型为主的腺癌中，且不易发生在以贴壁型为主的腺癌中，与本组前期报道[9]相似。既往研究认为NSCLC中KRAS与EGFR、BRAF、HER-2突变和ALK、ROS1重排是相互排斥的，但在本实验中发现3例标本同时存在KRAS和EGFR基因突变，其中1例还联合有PIK3CA基因突变，表明KRAS基因可与其它驱动基因同时突变。

文献报道PIK3CA在NSCLC中的突变率为2%～5%，可与EGFR等驱动基因同时发生。本组PIK3CA突变率为2.2%，男性突变率大于女性。在本实验中未见PIK3CA在腺癌突变率低于鳞癌突变率的情况，与文献报道不一致，这可能与本组中鳞癌例数较少有关。PIK3CA突变与组织学亚型无关，与Li等[11]结论相同。本实验统计发现在联合突变病例中PIK3CA与EGFR联合突变7例，且全部都为腺癌患者。提示PIK3CA与EGFR发生联合突变的概率较高。

ALK、ROS1、RET融合基因突变病例更容易发生在以实体型为主型的腺癌中，与既往研究[12]一致。ALK重排更容易发生在<62岁，非吸烟腺癌患者，但差异无统计学意义，与以往研究基本一致[13]。本实验亦发现有淋巴结转移者较易发生ALK突变。RET重排与患者性别、年龄、吸烟情况、组织学类型及临床分期无相关性，与既往研究[12]结论一致。以往文献报道RET不与其它突变共存[14]，但本组发现1例RET合并HER-2共同突变，因此RET与其它驱动基因并非完全排斥，只是概率较低。ROS1突变与临床病理无相关性，与Cai等[15]研究结果一致。

本实验中NRAS、BRAF、HER-2和MET基因突变均发生于周围型肺腺癌，与吸烟史、病理类型、临床分期均无相关。本组中有1例存在NRAS基因突变，突变率为0.2%，年龄59岁、非吸烟、病理学分期Ⅲ期的女性周围型腺癌患者。在肺癌中BRAF突变率较低，本实验共检测到8例BRAF突变，突变率为1.5%，这与以往统计相符合[16]。HER-2基因突变率为2.0%，略高于以往文献报道[17]。由于突变样本例数太少，具体临床意义仍需进一步探讨。本组366例NSCLC中，发现MET基因突变1例，突变率为0.3%，年龄82岁、病理学分期Ⅳ期的女性周围型腺癌患者。本次统计中MET基因突变率低于以往文献报道(4.4%)[17]，这有可能是由于本组病例较少或与MET突变具有地区差异有关。

以往研究多表明各驱动基因突变之间独立存在[18]，但随着基因检测技术的发展，越来越多的研究发现各驱动基因之间可有共存突变。本实验发现12例驱动基因联合突变和8例EGFR双位点突变，突变率分别为2.2%和1.5%。本实验结果显示，共存突变基因与临床病理特征有相关性，在驱动基因联合突变中PIK3CA与EGFR联合突变7例，统计结果显示，存在该联合突变的病例有较高的临床分期，提示PIKACA与EGFR联合突变的肿瘤恶性程度更大。EGFR双位点突变较易发生在乳头型腺癌和有淋巴结转移患者中。同时应用多种靶向药物治疗可能使该组罕见肺癌患者受益。

综上所述，NSCLC中EGFR、KRAS、ALK基因均存在较高的突变率，其它驱动基因以及驱动基因联合突变的突变率虽然低，但临床意义重大[19]。WHO(2015)肺癌分类中倡议：全面的分子图谱对肺癌的检查非常重要，肺癌中多分子改变的发现可能对这些患者有潜在的临床意义。因此，在治疗初期对肺癌患者进行多基因联合检测，有利于临床上加快筛选有效目标人群，使患者接受个体化的针对性治疗，提高治疗效果，在临床治疗上具有重要意义。