新旧指南下乳腺癌HER-2基因状态和蛋白表达及与临床病理关系的比较和再评价

罗斯译，高子清，陈 丽，肖秀丽，阮思蓓，张翠微，凌 凤，吴 宁，唐明希

乳腺癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，20%～30%乳腺癌患者存在HER-2过表达或扩增，而HER-2过表达或扩增患者对赫赛汀等靶向药物敏感性高[1]。因此，通过免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)正确检测和评价HER-2状态对乳腺癌治疗方案的选择和预后评估极其重要。目前，我国最新《乳腺癌HER2检测指南(2019版)》(以下简称新指南)已经发布[2]，本文根据新指南再评价1 518例乳腺癌患者IHC和FISH检测结果的一致性及其与各临床病理特征的关系，并比较分析与《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》(以下简称旧指南)[3]指南下判读结果的异同和优劣，为乳腺癌患者正确选择治疗方案和预后评估，特别是抗HER-2阳性靶向治疗患者个体化方案和预后疗效评估提供更为合理的参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2010年11月～2019年10月经西南医科大学附属医院病理科确诊为浸润性乳腺癌并行FISH和IHC检测的女性乳腺癌患者1 518例。组织标本主要来源于四川地区泸州、宜宾、内江、自贡、德阳等及川、滇、黔、渝结合部地区人群。文献报道乳腺浸润性导管癌穿刺标本与手术标本HER-2蛋白表达具有较高的一致性[4]，因此本实验选取浸润性乳腺癌根治手术切除标本和粗针穿刺标本，其中根治手术标本1 343例、粗针穿刺标本175例，年龄17～90岁。所有病例均有完整的FISH报告记录和ER、PR、HER-2等IHC切片及临床病理资料。根据新、旧指南中IHC和FISH判读标准对所有病例进行再判读和差异统计分析。FISH再判读主要通过查阅检测报告记录，IHC再判读由2名教授复阅切片完成。

1.2 试剂与探针IHC中ER(SP1)、PR(1E2)和HER-2(4B5)检测使用罗氏公司抗体；Ki-67(MIB.I)抗体由北京中杉金桥公司提供。FISH检测采用北京金普嘉公司HER-2基因扩增试剂盒。

1.3 方法

1.3.1IHC法 新鲜标本经10%中性福尔马林固定后石蜡包埋并连续3 μm厚切片，IHC操作步骤严格按照EnVision两步法试剂盒说明书进行，ER、PR、Ki-67阳性为细胞核呈棕色或棕褐色，HER-2阳性为细胞膜呈棕色。

1.3.2FISH法 按照北京金普嘉公司HER-2基因扩增试剂盒操作说明书进行FISH检测，具体操作步骤参照文献[5-6]。

1.4 结果判断

1.4.1IHC结果判断 HER-2蛋白表达强度判读参照新版指南[2]进行，与旧版[3]不同者主要为：针对IHC(2+)判读的第一种情况，由旧版本的>10%的浸润癌细胞呈现不完整和(或)弱至中等强度的细胞膜染色，改为>10%的浸润癌细胞呈现弱/中等强度的完整细胞膜染色。

1.4.2FISH结果判读 新、旧指南不同之处主要为：(1)旧指南HER-2/CEP17比值≥2.0判读为阳性，新指南还需结合平均HER-2拷贝数/细胞≥4.0才能判为阳性，对HER-2/CEP17比值≥2.0但HER-2拷贝数/细胞<4.0者，新指南还需增加细胞计数，结果不变者判为阴性。(2)旧指南中HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷贝数/细胞≥6.0者判读为阳性，新版下还需增加细胞计数，结果不变者判为阳性。(3)旧指南HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷贝/细胞数≥4.0且<6.0判为可疑，新指南要重新计数细胞后综合判读，若结果仍不变还需结合IHC结果进行判读，若IHC(3+)则判为阳性，若IHC(0～2+)则判为阴性。

1.5 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，HER-2基因状态及蛋白表达与临床病理特征的关系采用χ2检验及Gamma关联分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌中HER-2蛋白表达和HER-2基因扩增情况1 518例乳腺癌组织标本中，HER-2蛋白(-/+)者视为阴性，合计251例(16.53%)，(2+)和(3+)者均视为阳性，分别为1 084例(71.41%)和183例(12.06%)。HER-2基因扩增406例(26.75%)，无扩增1 112例(73.25%)(图1～4)。

①②③④

2.2 IHC和FISH检测乳腺癌中HER-2蛋白表达、基因扩增的一致性新指南下，HER-2蛋白阳性率为83.47%(1 267/1 518)，HER-2基因扩增率为26.75%(406/1 518)。在1 267例HER-2蛋白阳性患者中有397例HER-2基因扩增，其中HER-2(2+)者263例，HER-2(3+)者134例，在406例HER-2基因扩增患者中有9例HER-2(-)。新、旧指南下HER-2蛋白表达和HER-2基因检测结果均相关(r=0.233，P<0.001；r=0.780，P<0.001)；HER-2(-/+)和HER-2基因阴性的符合率分别为100%和95.36%；HER-2(2+)和HER-2(3+)与HER-2基因阳性的符合率分别为24.26%和73.22%。新、旧指南中IHC(2+)与FISH检测符合率差异有统计学意义(P<0.001)，IHC(-/+)、IHC(3+)与FISH符合率差异无统计学意义(表1)。

表1 FISH及IHC检测HER-2基因状态和蛋白表达一致性

2.3 乳腺癌中HER-2基因扩增及HER-2蛋白表达与临床病理特征的关系ER、PR、ER/PR表达状态与HER-2基因扩增(χ2=229.674，P<0.001；χ2=93.935，P<0.001；χ2=96.466，P<0.001)及HER-2蛋白表达(χ2=65.436，P<0.001；χ2=92.133，P<0.001；χ2=41.207，P<0.001)差异有统计学意义；组织学分级与HER-2基因扩增及蛋白表达呈正相关(r=0.097，P<0.05；r=0.139，P<0.05)。ER表达与HER-2基因扩增及蛋白表达呈负相关(r=-0.606，P<0.001；r=-0.126，P<0.05)，PR、ER/PR状态与HER-2基因扩增呈负相关(r=-0.428，P<0.001；r=-0.428，P<0.001)，与HER-2蛋白表达无关(P>0.05)。此外，Ki-67与HER-2基因扩增相关，肿瘤大小与HER-2蛋白表达相关，年龄及淋巴结数量与HER-2基因扩增及蛋白表达无显著相关性(P>0.05，表2)。

表2 乳腺癌中HER-2蛋白表达、HER-2基因状态与临床病理特征的关系

3 讨论

随着抗HER-2阳性乳腺癌靶向药物的广泛应用，极大地提高了HER-2阳性患者的生存期[7]。因此，HER-2的精确检测和评估对乳腺癌患者治疗选择和预后判断具有重要意义。本实验根据新版指南对四川及周边地区1 518例乳腺癌患者FISH和IHC检测结果的一致性及与临床病理特征的关系进行了再评价，并与旧版指南结果进行了比较与分析。

新指南结果显示：IHC(-)和FISH阴性的符合率为100%，与旧指南结果相同；IHC(+)和FISH阴性的符合率为95.36%，略高于旧指南(94.33%)，这与新指南结果新增2例FISH阴性有关。因为新指南考虑到目前临床试验数据中仍缺乏充分证据证明HER-2/CEP17比值≥2.0，平均HER-2拷贝数/细胞<4.0的患者能从HER-2靶向治疗中获益[8-9]，因此，新指南有效规避了旧指南标准下1例的FISH“假阳性”和1例“可疑”的判读结果，对临床用药指导更为准确；新版指南下IHC(2+)和FISH阳性符合率为24.26%，略低于旧指南的25.65%，这与新指南删除了“可疑”判读标准有关，在新指南判读标准下减少了15例FISH阳性和增加了79例FISH阴性结果，相应地有效规避了15例旧指南FISH“假阳性”和64例“可疑”结果的不确定性判读，使临床靶向药物的应用更加准确和完善；新指南下IHC(3+)和FISH阳性符合率为73.22%，略高于旧指南的70.49%，这是基于新指南删除“可疑”判读从而新增了5例FISH阳性结果所致，同样体现了新指南标准的更具明确性和科学性。因为现有的循证医学依据显示HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷贝数/细胞≥4.0且<6.0(0～2+)患者能否从抗HER-2靶向治疗中获益，目前仍未得到充分证明[10-11]。

本组中IHC(2+)与FISH检测的符合率差异有统计学意义，这与新指南取消64例HER-2“可疑状态”判读标准有关，体现了新标准下更为明确的判读结果。新、旧指南间IHC(-/+)和IHC(3+)者与FISH检测的符合率差异均无统计学意义，可能与本组中IHC(-/+)和IHC(3+)样本量较少和旧标准“可疑判读”例数较少有关。本组结果也体现了新指南对旧指南的有效补充与完善，并结合临床实践，使乳腺癌患者用药标准及预后判断更加明确和准确。本组中IHC(-/+)与FISH阴性具有高度的符合率(100%，95.36%)。但IHC(3+)与FISH阳性的符合率较低(73.22%)，与IHC(3+)样本量较少[因临床上只要IHC(3+)便可直接用靶向药，而并不推荐再行FISH检测]有关，并且多为5年以前的样本，这与当时样本固定也有关。除此以外，IHC检测结果也受抗原修复方法的影响[12]。有报道显示IHC(3+)伴FISH阳性者靶向用药的预后要好于IHC(3+)但FISH阴性者[11]，且有研究认为HER-2拷贝数可为HER-2阳性浸润性乳腺癌患者提供预后信息，HER-2拷贝数高的IHC(3+)和(2+)患者预后较好[13]。据此，我们认为IHC(2+～3+)者都应进一步行FISH检测，以完善诊断，指导治疗和判断预后。

新、旧指南下，ER表达与HER-2基因扩增和HER-2蛋白表达均呈负相关。PR、ER/PR状态与HER-2基因扩增也均呈负相关，与HER-2蛋白表达无相关性，提示ER、PR阴性患者预后较差可能与HER-2高表达及基因扩增有关，ER阴性者同时也与HER-2蛋白表达呈负相关；新指南下Ki-67增殖指数和HER-2基因扩增呈正相关，肿瘤大小和组织学分级与HER-2蛋白表达均呈正相关，与本组之前的报道一致[4-5]。另外，新指南判读结果显示乳腺癌患者年龄、淋巴结转移数与HER-2基因扩增无相关性，与旧指南报道的呈正相关相反，可能的原因为新指南IHC(2+)时的判读标准为“>10%的浸润癌细胞呈现弱～中等强度的、完整细胞膜染色[2]”，取代了旧指南的“>10%的浸润癌细胞呈现不完整和(或)中等强度的细胞膜染色[3]”的判读；另外，新指南对旧指南中FISH判读标准进行了补充和修改，取消了FISH“可疑”的判读，避免了旧指南假阳性判断，使FISH阳性和阴性例数发生了变化。由于本组样本量的局限性，且仅限于四川及川、滇、黔、渝结合部地区患者，这些相关性的证实还有待长期、大量、多中心的回顾性研究来进一步证实与完善。

综上所述，新版指南结合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2基因拷贝数及临床实践，通过取消HER-2基因“可疑”判读及IHC对HER-2蛋白结果判读的影响等标准的修改，使临床对HER-2状态的诊断更为明确和合理，对乳腺癌患者靶向用药及预后判断更加精准和完善。