气单胞菌的分离鉴定与耐药性研究

○张卫青 祭仲石 韦 艳

气单胞菌属于γ－变形菌纲、气单胞菌目、气单胞菌科、气单胞菌属（Aeromonas）。气单胞菌是水产养殖中多种疾病的病原菌，广泛存在自然水体与养殖水体中，在池塘水质恶化，养殖对象体质下降时往往诱发疾病，给水产养殖带来重大损失。气单胞菌是一种重要的淡水养殖病原菌，可以感染多种水产动物，其中以细菌性败血症最为严重，该病爆发迅速，一旦爆发往往造成巨大的损失。目前鱼类的细菌性疾病的治疗主要还是依靠内服抗生素，但是，抗生素的大量使用容易产生耐药菌株，同时抗生素在鱼体内残留也导致了食品安全问题。

我国水产养殖基础建设相对落后，特别是养殖池塘，随着多年的养殖，池塘底泥中沉积了大量的有毒有害物质和致病菌，在缺乏科学指导的情况下，往往根据经验使用药物，甚至有些养殖企业在疾病得不到有效控制的时候，挺而走险，使用明令禁止的违禁药物。目前，水产养殖用药指导缺少有效的指导手段，多数凭经验用药，抗生素的滥用乱用导致致病菌的耐药性不断增强，药物的使用量也不断增大，从而导致水产品的质量安全隐患进一步加剧。为及时有效地控制疾病，针对性地使用药物，从发病水产动物中分离病原菌，测定其对各种抗菌药物的敏感性，指导合理用药，是保证药物治疗效果的关键。

本文通过药物敏感实验，以水产养殖中常用的恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素、诺氟沙星等内服抗生素为实验对象，分析养殖中爆发细菌性败血症分离的气单胞菌的耐药性，以期寻找最佳治疗药物，为养殖生产提供合理有效的用药方案，指导生产，减少盲目用药带来的损失。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用抗生素原料药采购自上海生工；PCRMix、EB、细菌基因组提取试剂盒采购自北京艾德莱；用于扩增气单胞菌的引物由上海生工合成；微生物培养基为脑心浸液培养基（BHI），ph7.4±0.2，采购自OXOID；实验用嗜水气单胞菌菌株于2018年5月、2019年10月取自大丰某养殖场爆发性出血病鱼样。

1.2 分离病原菌

在超净工作台中，从患病鱼肝、脾、肾等组织处取样，用灭菌后的接种环分别在培养基平皿的边缘的四个点涂菌，以每个点开始划线至培养基平皿中的1/2。然后，再以到第二点划线至培养基平皿中的1/2，依次划线，直至将致病菌均匀密布于培养基平皿中，如图1。30℃培养24小时。挑选优势菌落接种于斜面培养基，30℃培养24小时，4℃冰箱保存备用。从斜面培养基上挑取菌落，接种到BHI液体培养基中，30℃培养24小时。

1.3 致病菌鉴定

按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取分离到的致病菌DNA，使用气单胞菌16S rDNA引物扩增致病菌DNA，正向引物F:GCGGGTACGACGCACCTTGC、逆向引物R:CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA，目的片段长度为1091bp，扩增条件为94℃预变性4 min，94℃变性40 s，54℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增后，用添加EB的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压120V、电泳15min。电泳后使用紫外分析仪观察结果。

1.4 制备药敏纸片

将抗生素原料药配置成1000mg/L，在超净工作台中使用0.22μm针式过滤器过滤，取滤液备用。用打孔机将定性滤纸打成6.0mm直径的圆形纸片，将圆形纸片放入培养皿中，经高压灭菌后，放在37℃烘箱中数天，使其完全干燥。将圆形纸片均匀分布在培养皿中，用微量移液器向每片纸片上加10μL药液，使每片纸片上含有抗生素10μg，做好标记，置于37℃烘箱内干燥，-20℃密封保存。

1.5 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法（K-B法），在超净工作台中，将分离鉴定的气单胞菌用生理盐水制备成浓度约107-108cfu/mL细菌悬浊液，然后取100μL涂布于BHI平板，等待15分钟，将不同的药敏纸片均匀的贴在BHI平板上，30℃培养24小时后，观察结果，量取抑菌圈直径，选择抑菌圈最大的药物作为生产用药，并统计各致病菌对不同抗生素的敏感性。

2 结果

2.1 致病菌的鉴定

患病鱼样表现为腹部、鳍条基部等多处充血，鱼眼球突出，解剖后腹腔内有红色腹水，肠道充血，肠内无食，如图2。致病菌在BHI培养基上生长较快，24h后可见明显菌落，菌落呈圆形，边缘光滑，淡白色，见图3左。分离致病菌的PCR扩增结果中，条带大小和预期目的片段大小一致，见图3右，琼脂糖凝胶电泳显示如图，1-6号在1091bp左右有亮带，7号无明显条带，与预期结果相同，说明引起爆发性出血病的致病菌是气单胞菌。

图2 患病鱼症状

图3 致病菌形态及DNA电泳图谱

2.2 内服抗生素敏感性

图4 药敏结果

每次实验量取抑菌圈，选择抑菌圈最大的药物作为治疗药物，如图4。本试验中，用于药敏实验的气单胞菌共155株。下表显示了不同鱼类分离的致病菌耐药性频度分布。结果表明，分离的致病菌多数对氟苯尼考、恩诺沙星和强力霉素较为敏感，其中对氟苯尼考敏感的有62个菌株，占总数的40%；对恩诺沙星敏感的有49个菌株，占总数的32%；对强力霉素敏感的有28个菌株，占总数的18%，其它抗生素敏感率较低。结果表明，分离的气单胞菌主要对氟苯尼考、恩诺沙星和强力霉素这三种抗生素敏感。

不同菌株对抗生素的敏感性

3 讨论

气单胞菌是常见的水产致病菌，广泛存在养殖水体中，一旦养殖环境恶化，将导致各种细菌性疾病的爆发。爆发性出血病一般在5-9月发病，且水温越高，爆发机率越大。该病主要危害草鱼、鲫鱼、团头鲂、白鲢等，从鱼种到成鱼均可感染，此病爆发性强，死亡率高。爆发性出血病患病鱼体表充血、出血严重，病鱼的下颌、眼球、吻端、各鳍条充血，鱼眼球突出，肛门红肿出血，腹部膨大，解剖后腹腔内有红色腹水，肝、脾、肾肿大，严重出血，肠道粘膜出血，发红，肠内无食。

本实验对大丰地区某水产养殖场两年中爆发出血病的鱼分离的致病菌进行鉴定和药物敏感性实验。16S rDNA鉴定结果表明，引起爆发性出血病的致病菌是气单胞菌。药物敏感性实验结果表明，本地区常见致病菌多数对氟苯尼考、恩诺沙星和强力霉素较为敏感。由于各地区养殖环境不同，养殖品种有所差异，用药习惯等不同，造成致病菌敏感性有所差异，因此，本文结果只代表当地致病菌敏感性。在发生细菌性出血病时，可以优先考虑氟苯尼考、恩诺沙星和强力霉素，再根据后续药敏实验，确定使用何种药物治疗。

在防治爆发性出血病时可根据气单胞菌的耐药性合理选择抗菌药物，严格把握用药剂量、给药方式等，同时需要加强对耐药菌株的监测，以减少致病菌耐药性的产生，本文结果以期为大丰地区水产养殖爆发性出血病防治过程中抗生素的合理使用提供一定的参考。由于市场中水产药物质量参差不齐，假药、劣质药物繁多，还需要在今后的工作中进行同种药物的横向比较，以更好的指导生产，减少使用假药、劣质药物带来的损失。

（通联：224151，上海市海丰水产养殖有限公司手机：17306253189）