水杨酸对乌龙茶咖啡碱代谢生理特性的影响

摘要 [目的]研究外源水杨酸对乌龙茶咖啡碱合成代谢的影响。[方法]以乌龙茶品种“铁观音”幼苗为试验材料，分析外源水杨酸对乌龙茶叶片咖啡碱含量、咖啡碱合成酶基因表达及其合成途径中间代谢产物含量的影响。[结果]外源水杨酸提高乌龙茶叶片咖啡碱含量、激活乌龙茶咖啡碱合成酶的基因表达，增加咖啡碱可可碱、1，7-二甲基黄嘌呤和茶碱等合成途径中间产物的含量，有利于咖啡碱的累积。[结论]水杨酸对咖啡碱生物合成具有浓度效应，2.0 mmol/L 水杨酸最有利于铁观音咖啡碱的生物合成。

关键词 铁观音;外源水杨酸;咖啡碱;生理特性;基因表达

中图分类号 S571.1  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）19-0048-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.014

Abstract [Objective]To study the effects of exogenous salicylic acid on the synthesis and metabolism of caffeine in Oolong tea.[Method]The seedlings of Tieguanyin，a oolong tea variety，were used to study the effects of different concentrations of salicylic acid on the gene expression of caffeine，caffeine synthetase and the content of intermediate products of caffeine synthesis pathway.[Result]Exogenous salicylic acid increased the content of caffeine in Oolong tea，activated the gene expression of caffeine synthetase，and increased the content of theobromine，1，7dimethylxanthine and theophylline，the intermediate products of caffeine synthesis pathway，so as to promote the biosynthesis of caffeine.[Conclusion]Salicylic acid has a concentration effect on caffeine metabolism，2.0 mmol/L salicylic acid is the most favorable for caffeine production.

Key words Tieguanyin;Exogenous salicylic acid;Caffeine;Physiological characteristics;Gene expression

基金項目 福建省产业技术联合创新项目（闽发改高技〔2014〕514号）;泉州市科技计划项目（2018N16）。

作者简介 蔡金福（1977—），男，福建南安人，高级农艺师，从事茶树品种选育与高效生产技术研究。

收稿日期 2019-12-18;修回日期 2020-03-06

福建是全国最大的乌龙茶生产省份和发源地，生产历史悠久，产品特色明显，在国内外市场享有较高的声誉。福建素有“茶树良种王国”之称，也是国内乌龙茶茶树品种资源最丰富的地区[1]。茶叶品质主要包括茶叶中的氨基酸指数以及茶多酚的含量，还包括咖啡碱以及可溶性糖的含量等。咖啡碱是茶汤中苦味的重要物质基础，对茶叶品质有非常重要的影响[2]。它具有兴奋神经中枢、提神和醒脑的功效，同时对人的呼吸和心脏系统也有兴奋作用[3]。另外，咖啡碱在治疗癌症、阿尔兹海默病、帕金森病[4]等方面也有一定的作用。

水杨酸是小分子酚类化合物，普遍存在于植物体内，通过调节植物的各代谢途径，从而诱导植物体内合成酚类、黄酮类等次生代谢产物[5-6]。外源水杨酸在植物抗性应用方面已有相关报道[7-9]，咖啡碱代谢研究主要集中于微生物发酵、外源诱导物ZMZ和合成基因功能等方面[10-11]，利用外源水杨酸调节咖啡碱代谢的研究鲜见报道[12]。鉴于此，笔者对 “铁观音”2年生盆栽苗喷施外源水杨酸进行了研究，分析乌龙茶叶片咖啡碱含量、咖啡碱合成酶基因表达和咖啡碱合成途径中前体物质含量的变化，探索乌龙茶树咖啡碱生物合成的生理特性，旨在为乌龙茶高产优质栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以种植于安溪县茶叶生产基地内的2年生“铁观音”乌龙茶幼苗为材料，铁观音幼苗健康且生长健壮。将铁观音幼苗种植于塑料盆中，每盆种植3株;培养1个月，待幼苗正常生长后，选取枝梢长势相对一致的盆栽苗用于试验。

1.2 试验设计

2019年4—5月对茶树进行喷施水杨酸处理，浓度分别为1.0、2.0、3.0和4.0 mmol/L，对照处理为蒸馏水，共设计5个处理，每盆为1个处理，每个处理3次重复，随机区组设计，各处理间隔50 cm摆放。在晴朗天气09：00前叶面喷施水杨酸，每个星期喷施1次，共处理4次;试验期间用塑料薄膜遮挡自然降雨，其他按茶园田间管理进行。试验结束后采集成熟功能性叶片用于各项生理指标测定，叶片选取位于相同方向和节位的枝条。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 样品的制备。各处理采集的茶叶样品分为2份，其中1份烘干制备成干样，另1份用新鲜样品;样品分别采用热水浸提、热水超声波、75%乙醇浸提、75%乙醇超声波4种方式进行提取待测液。提取方法为：称取样品150 mg，置于25 mL烧瓶中，加入沸水（或75%乙醇）20 mL，在水浴中浸泡45 min（或超声提取45 min），过滤，定容至25 mL，置于-4  ℃冰箱中备用。

1.3.2 咖啡碱合成途径相关物质含量的测定。采用高效液相色谱法测定咖啡碱合成途径中间产物可可碱、1，7-二甲基黄嘌呤、茶碱和咖啡碱4种物质含量[13]。色谱柱采用InertsiL-ODC C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），35 ℃柱温;流动相为甲醇/超纯水=40/60，流速为0.4 mL/min，20 μL进样量;在271 nm波长下检测。

1.3.3 咖啡碱合成酶基因表达。

RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒;以总RNA为模板合成cDNA第1链;以cDNA为模板应用SYBR Premix ExTaqTMII试剂盒进行荧光定量表达，咖啡碱合成酶基因（TCS）引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

以GADPH为内参基因，每个样品对照基因与测定基因分别设3个重复和1个阴性对照，反应结束后观察溶解曲线及扩增曲线，采用2-ΔΔCT法进行相对表达量计算。

1.4 数据处理与分析 采用Microsoft Excel 2013进行数据整理和图表制作，采用Duncans新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 咖啡碱前体物质含量的回归方程 咖啡碱合成途径中的主要物质有1，7-二甲基黄嘌呤、可可碱、咖啡碱和茶碱。采用高效液相色谱法建立4种物质标准样品的回归方程，4种物质标准品混合溶液的分离图谱见图1。从图1可以看出，咖啡碱合成途径4种物质的保留时间不同，其出峰先后顺序分别为可可碱、1，7-二甲基黄嘌呤、茶碱和咖啡碱。

以4种物质标准品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归分析，这4种物质的相关系数均大于0.99，符合回归方程要求，建立咖啡碱合成途径中间物质1，7-二甲基黄嘌呤、可可碱、咖啡碱和茶碱的回归方程（表2）。

2.2 样品提取方式对咖啡碱含量的影响

样品制备和提取方法对茶叶咖啡碱含量有直接影响。由图2可知，样品烘干后咖啡碱含量显著高于鲜样，咖啡碱含量提高了98.4%～190.0%，其中75%乙醇超声处理的咖啡碱含量最高，为7.549 μg/mg，这主要是由于烘干降低样品的含水量，从而提高咖啡碱含量。

不同提取方式中，热水结合超声波处理的咖啡碱含量高于热水浸提处理，乙醇结合超声波处理的咖啡碱含量显著高于乙醇浸提处理，这是由于超声波处理加快样品中细胞破裂有利于咖啡碱的提取。提取溶剂中，75%乙醇处理的咖啡碱含量显著高于热水处理，这是由于有机溶剂能促进咖啡碱溶解，从而提高咖啡碱提取效果。因此， 75%乙醇结合超声波处理样品能准确提取茶叶中咖啡碱。

2.3 水杨酸对乌龙茶咖啡碱含量的影响

乌龙茶树喷施水杨酸能够提高茶叶咖啡碱含量。由图3可知，随着水杨酸浓度的增加，茶叶咖啡碱含量出现先升高后下降的变化，且水杨酸处理的咖啡碱含量均显著高于对照;2.0 mmol/L水杨酸条件下，咖啡碱含量达到最大值，比对照增加29.3%;随后咖啡碱含量缓慢下降;4.0 mmol/L水杨酸时，咖啡碱含量降为最低值，但仍高于对照。因此，水杨酸对咖啡碱合成起到明显的促进作用。

2.4 水杨酸对乌龙茶咖啡碱合成酶基因表达的影响

咖啡碱合成酶（TCS）是茶树中咖啡碱合成途径的关键酶基因。由图3可知，喷施水杨酸后，茶树的咖啡碱合成酶基因相对表达量显著提高;随着水杨酸浓度的增加，TCS基因相对表达量呈先上升后下降的趋势，2 mmol/L水杨酸条件下， TCS基因相对表达量达到最大值，比对照增加2.18倍;随后TCS基因表达量下降;4 mmol/L水杨酸条件下，TCS基因相对表达量降为最低值，但比对照增加98.06%，且显著高于对照。

2.5 水杨酸对咖啡碱合成途径中间物含量的影响

可可碱、1，7-二甲基黄嘌呤和茶碱是咖啡碱合成途径中间产物，是咖啡碱的前体物质，直接影响咖啡碱的生成。由图5可知，咖啡碱合成途径前体物质含量的变化与咖啡碱含量变化基本一致。水杨酸处理均显著提高可可碱、1，7-二甲基黄嘌呤和茶碱含量;随着水杨酸浓度逐渐升高，咖啡碱合成途径3种前体物质呈先升高后下降的趋势;1.0 mmol/L水杨酸条件下，3种前体物质可可碱、1，7-二甲基黄嘌呤和茶碱含量均达到最大值，分别比对照增加60.89%、53.51%和498.69%;随后这3种前体物质含量均逐渐降低;水杨酸浓度为4.0 mmol/L時，3种前体物质含量降为最低值，但仍显著高于对照。

3 结论与讨论

水杨酸是植物抗逆的内源信号物，可以激活植物的防御反应，诱导植物体内某些次生代谢产物的生物合成[5]。植物中高水平的水杨酸可诱导香豆素、类胡萝卜素等多种羟基苯甲酸和羟基苯丙烯酸衍生物的合成[14]。水杨酸处理丹参细胞可增加丹参细胞里酚类物质，也可提高超氧化物歧化酶、过氧化物酶和羟基苯丙酮酸双氧化酶等酶的活性[15]。添加低浓度水杨酸提高人参皂苷和糖苷的合成量[16-17]。在黄芩愈伤组织继代培养中添加50 μmol/L水杨酸时，黄芩苷含量提高1.63 倍[18]。该研究中喷施2.0 mmol/L水杨酸可显著促进茶树咖啡碱含量的增加，而较高浓度的水杨酸对咖啡碱的生成不明显，这与前人的研究报道基本一致。因此，叶面喷施适宜浓度的外源水杨酸（2.0 mmol/L）可以提高茶树咖啡碱含量，有效促进咖啡碱积累。

水杨酸还可以诱导植物体内某些次生代谢产物的生物合成[19]。咖啡碱作为茶树中重要的次生代谢产物，其体内合成也受到咖啡碱合成代谢途径基因表达的调控[12，20]。Maluf 等[21]发现高咖啡碱含量的果实中咖啡碱合成酶表达量较高，低咖啡碱含量的果实中咖啡碱合成酶表达量较低。李金等[22]比较茶树咖啡碱合成途径中TCS1、TIDH、SAMS的基因表达量差异与咖啡碱含量的相关性后，发现TCS1对茶树咖啡碱的合成起到重要作用。邓威威等[23]克隆出茶树咖啡碱合成酶基因，构建了TCS1原核表达质粒，同时成功制备了抗TCS1的多克隆抗体。该研究中咖啡碱合成酶（TCS1）对咖啡碱合成代谢起到主要作用，2.0 mmol/L水杨酸有利于提高咖啡碱合成途径酶基因的表达。目前，虽然克隆了部分参与咖啡碱合成代谢的关键酶基因，但是咖啡碱代谢途径的转录调控网络还不清楚;水杨酸等外源物对铁观音咖啡碱代谢调控机理仍有待进一步研究。

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