高效液相色谱法研究枸杞子中枸杞红素含量

庄晶玲 ，于洋，杨丽丽，张金宏，靳艳*，冯斌*

1. 中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所（大连 116023）；2. 大连医科大学（大连 116044）；3. 百瑞源枸杞股份有限公司（银川 750200）

枸杞（Lycium chinenseMiller）是茄科植物，枸杞果实枸杞子是中国传统的药食同源药材，《中药大辞典》记载枸杞子具有滋补肝肾、益精明目的功效[1]。枸杞子含有枸杞多糖[2]、黄酮、多酚[3]、类胡萝卜素[4]等多种活性物质，具有抗氧化、降血脂、抗衰老、保肝等生物活性[5]。玉米黄素二棕榈酸酯（Zeaxanthin dipalmitate）是枸杞子中的最主要的类胡萝卜素，国内枸杞研究及产业界又将玉米黄素二棕榈酸酯称为枸杞红素。枸杞红素是一种富含氧的类胡萝卜素，分子结构上含多个不饱和双键，分子式为C72H116O4（CAS号：144-67-2），其化学结构见图1。枸杞红素经皂化反应后可脱去二棕榈酸生成玉米黄素（Zeaxanthin），玉米黄素和叶黄素是人类视网膜上的主要色素。玉米黄素具有强抗氧化性，大量的人体试验研究结果表明，补充叶黄素和玉米黄素可改善视觉系统处理速度[6]、降低老年黄斑变性风险[7]，因此玉米黄素具有明确的改善视健康的功效。玉米黄素遇光、热、酸等不稳定，与游离的玉米黄素相比酯化玉米黄素——枸杞红素则较为稳定，因此枸杞子中的枸杞红素更易于发挥药效[8]。

图1 枸杞红素的化学结构图

枸杞子是含有枸杞红素含量最高的植物之一[9]，枸杞子的益精明目功效与其富含枸杞红素密切相关。Weller等[9]最早利用高效液相色谱串联质谱（LC-MS）分析红辣椒、锦灯笼、枸杞子等植物中枸杞红素及玉米黄素，其中枸杞子中的枸杞红素含量最高，为0.082 4%。Peng等[10]用高效液相色谱法测定不同品种的枸杞子中枸杞红素，其含量在0.03%～0.5%之间。Zhao等[11]将枸杞子中的枸杞红素皂化为玉米黄素，用高效液相色谱法测定不同品种的枸杞子中玉米黄素，其含量在0.006%～0.15%之间。虽然HPLC被用于枸杞子中枸杞红素含量的测定，但是现有的研究并没有系统研究品种、加工方式、产地等因素对枸杞红素的影响。

宁夏是中国枸杞子地道产区，也是中国枸杞的主要种植基地，宁夏的枸杞产量约占全国枸杞产量的20%，因此宁夏枸杞在中国枸杞产业中占据重要的地位。枸杞红素含有极强的抗氧化性，使其极易受环境因素影响[12]。枸杞红素中存在共轭双键，即含有长链不饱和双键结构体系，使枸杞红素极其不稳定[13]，其对温度等环境因素特别敏感容易异构化或降解。试验将以宁夏枸杞为对象，系统研究枸杞子品种、产地、等级及加工方式对枸杞子中枸杞红素含量的影响，并研究枸杞红素的稳定性，为筛选富含枸杞红素的枸杞子，以及保存枸杞红素提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞样品（百瑞源枸杞股份有限公司）；枸杞红素标准品（纯度95%，法国Extrasynthese，ZES-0309S）；甲醇、二氯甲烷、乙腈（均为色谱纯，天津科密欧）；正己烷、乙酸乙酯、乙醇（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

日立5000高效液相色谱系统（含四元色谱泵、双波长紫外检测器、柱温箱和自动进样器，日本Hitachi公司）；AX120电子天平（日本Shimadzu公司）；Allegra 64R高速离心机（美国Beckman公司）；离心浓缩机（美国Thermo公司）；JYL-D050料理机（九阳股份有限公司）；Scientz-II D超声细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；Milli-Q超纯水一体机（美国Millipore公司）；旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；手套箱式隔离器（美国VAC公司）。

1.3 色谱条件

高效液相色谱法参考文献[9]并稍作修改。色谱柱：YMC-carotenoid（C30）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μmol/L）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；流动相A为甲醇-乙腈-水（81︰14︰5，V/V），流动相B为二氯甲烷；梯度洗脱条件：0～3 min，84%A；3～23 min，83%～45% A；23～38 min，45%～25%A；38～43 min，25%～25% A；43～45 min，25%～84%A；检测波长450 nm。

1.4 标准溶液的配制

精密称取枸杞红素标准品，用高效液相色谱的流动相A-流动相B（1︰1，V/V）溶液溶解，配制成100 μg/mL标准溶液。

1.5 枸杞红素提取方法

精确称取10 g枸杞子，加5倍水于JYL-D050料理机中打碎，于8 000 g离心10 min，取沉淀冷冻干燥得到枸杞子粗渣。取1 g枸杞子粗渣，加入150 mL正己烷-乙醇混合液（2.6︰1，V/V），以200 r/min机械搅拌20 min，即枸杞子提取液，冷冻干燥枸杞子提取液，即为枸杞红素提取物。样品用0.22 μmol/L有机相滤膜过滤后用于高效液相色谱分析。

1.6 枸杞红素提取物稳定性样品的制备

冷冻干燥枸杞子提取液，即为枸杞红素提取物，用于枸杞红素提取物稳定性的研究。将枸杞红素提取物，分别在空气环境和氩气环境保存考察稳定性。空气环境的样品分别保存于室温和4 ℃环境；氩气保护的样品在手套箱氩气环境中将气体置换为氩气并密封，分别保存于室温和4 ℃环境。4组样品分别于0，3，9，15，60和120 d测定其枸杞红素残余率。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法分析枸杞红素

利用1.3小节的色谱条件分别分析枸杞红素标准品及特级宁杞7号枸杞子提取液，色谱图分别见图2。枸杞红素标准品在保留时间29.99 min处的峰为枸杞红素，枸杞子提取液的色谱图中主要峰为保留时间29.98 min的峰，其保留时间与枸杞标准品基本一致，初步推断该峰为枸杞红素。

为进一步确认图2（B）中枸杞子提取液中的主峰为枸杞红素，对该峰在波长300～600 nm范围内扫描，将枸杞子提取液的主峰的紫外吸收谱与枸杞红素标准品的紫外吸收谱做比对，结果见图3。可见在波长300～600 nm范围内，枸杞子提取液中的主成分与枸杞红素标准品吸光度特征一致，因此可认为枸杞子提取液中保留时间29.98 min的峰为枸杞红素。

分别配制质量浓度5，10，25，50和100 μg/mL的枸杞红素标准溶液，进行高效液相色谱分析，利用峰面积与枸杞红素浓度绘制标准曲线，线性回归方程为Y=61 887X-80 482，R2=0.999 5，枸杞红素在5～100 μg/mL内线性关系良好，定量限LOQ=0.6 mg/kg。

2.2 不同品种的枸杞子中枸杞红素含量

宁杞7号和宁农杞2号是宁夏种植面积较大的2个枸杞品种，利用高效液相色谱法测定同产于宁夏中宁的宁杞7号和宁农杞2号的枸杞子中的枸杞红素含量，结果见表1。结果显示，在产地、等级和干燥方式相同的情况下，宁杞7号的枸杞红素含量几乎是宁农杞2号的枸杞红素含量的两倍，为2.74±0.11 mg/g。

图2 枸杞红素标准溶液的色谱图（A）与枸杞子提取液的色谱图（B）

图3 枸杞红素标准品与枸杞子提取液的紫外吸收谱图

表1 不同品种枸杞子中枸杞红素含量（n=3）

2.3 产地对枸杞子中枸杞含量的影响

近年来枸杞种植的产业不断扩大，枸杞的种植地从宁夏中宁扩大到宁夏其他地区乃至其他省份。比较产于宁夏中宁、贺兰山、红寺堡及青海省的宁杞7号枸杞子中的枸杞红素含量，结果见表2。在其他条件相同的情况下，产于宁夏中宁的枸杞子中枸杞红素含量显著高于其他3个产地，宁夏红寺堡和青海产地的枸杞子的枸杞红素含量相当。从枸杞红素含量的角度来看，宁夏中宁地区作为枸杞的主产地具有天然的优势。

表2 不同产地的枸杞子中枸杞红素含量（n=3）

2.4 等级对枸杞子中枸杞红素含量的影响

以宁杞7号为对象，研究不同等级的枸杞子中枸杞红素的含量。枸杞子等级是百瑞源枸杞股份有限公司按照GB/T 18672—2014进行分级提供，结果见表3。在产地、干燥方式相同的情况下，特级枸杞子中枸杞红素含量最高为2.74±0.11 mg/g，随着等级下降枸杞红素含量逐渐降低，乙级的枸杞中枸杞红素仅1.64±0.09 mg/g。

表3 不同等级的枸杞子中枸杞红素含量（n=3）

2.5 干燥方式对枸杞子中枸杞红素含量的影响

新鲜枸杞不易保存，干燥加工是枸杞子最关键的加工步骤。传统的自然晒干方式仍被广泛使用，近年来随着技术发展，热风干燥、真空干燥等技术也被逐渐应用于枸杞子加工中[11]。以宁夏中宁产甲级的宁杞7号枸杞子为对象，研究热风干燥、真空干燥和自然晒干等几种干燥方式对枸杞子中枸杞红素的影响，结果见表4。结果可见，热风干燥枸杞子中枸杞红素含量最高，为2.59±0.051 mg/g；自然晒干的枸杞子中的枸杞含量最低，为1.97±0.040 mg/g。

表4 不同干燥方式对枸杞子中枸杞红素含量的影响（n=3）

2.6 枸杞红素提取物稳定性

按照1.6小节制备枸杞红素提取物，制备成保存于隔绝空气的氩气密封袋和暴露于空气的样品，2种样品分别保存于4 ℃冰箱和室温，利用HPLC检测保存过程中枸杞红素的残留率。图4和图5分别为未经保护的空气和氩气保护环境下枸杞红素的残余率变化规律。由图4可见，在室温环境下，暴露于空气120 d的枸杞红素残余率约为71.19%，而保存于4 ℃环境下的枸杞红素样品残余率为85.48%，说明低温可显著改善长期保存的枸杞红素的稳定性，特别是对于暴露于空气中的样品，这种改善尤其明显。

由图5可知，氩气保护下稳定性好于空气中样品，经过120 d后枸杞红素均在83%以上，说明如果隔绝空气氩气保存也可改善枸杞红素的稳定性。枸杞红素提取物中枸杞红素在前15 d枸杞红素的稳定性变化较大，15 d后逐渐趋于稳定。枸杞红素提取物最佳的保存条件是隔绝空气低温保存，以这种方式放置120 d后的枸杞红素残余率约87.41%，因此这种方式可作为枸杞红素提取物的一种保存方式。

图4 空气环境下枸杞红素的残余率

图5 氩气环境下枸杞红素的残余率

3 结论与讨论

建立高效液相色谱法分析枸杞子中枸杞红素的方法，研究枸杞子品种、产地、等级、干燥方式等因素对枸杞红素含量的影响。

比较了宁夏中宁产的宁杞7号和宁农杞2号2个品种枸杞子中的枸杞红素含量，宁杞7号的枸杞子的枸杞红素含量明显高于宁农杞2号枸杞子，为2.74±0.11 mg/g。比较产于宁夏中宁、贺兰山、红寺堡及青海省的宁杞7号枸杞子中的枸杞红素量，结果显示宁夏中宁的枸杞子中枸杞红素含量最高，虽然枸杞红素并不是道地药材的评价标准，但枸杞红素含量的结果说明宁夏中宁的气候及地理位置非常有利于枸杞子中枸杞红素的积累。比较特级、甲级、乙级宁杞7号枸杞子的枸杞红素含量，结果显示枸杞红素含量与枸杞子等级密切相关，特级枸杞子中枸杞红素含量最高，随着等级下降枸杞红素含量逐渐降低。比较经过热风干燥、真空干燥、自然晒干处理的宁杞7号枸杞子中的枸杞红素含量，热风干燥枸杞子中枸杞红素含量最高，自然晒干的枸杞子中枸杞红素含量最低，两者相差近1倍，说明传统的晒干模式并不利于枸杞红素的稳定。由于枸杞红素对光、热、氧气等因素敏感，自然晒干时光照、温度、时间等条件不可控，导致部分枸杞红素降解，因此现代温度时间可控的干燥方式更有益枸杞子中枸杞红素的保存。

枸杞红素作为枸杞中主要的类胡萝卜素，拥有良好的抗氧化性，主要原因是其含有较长的共轭双键和丰富的活性基团[12]，从而发挥良好的清除自由基的能力，但同时对于环境变化的不稳定性也显著增加。温度是一个影响枸杞红素稳定性的重要因素，随着温度增加枸杞红素的降解也随之增加，并且放置时间越久，氧化时间越久，也会使枸杞红素的稳定性下降，因此在储存枸杞红素冻干粉的时候，应尽量避光、低温、隔绝空气。于4 ℃、隔绝空气的情况下保存120 d，枸杞红素残余率为87.41%，这种方式可作为枸杞红素提取物的一种保存方式。

越来越多的证据显示枸杞红素在眼健康、护肝[13]等方面的药用价值，然而天然植物中枸杞红素的含量是制约枸杞红素制备产业化的关键因素。即使是枸杞红素含量最高的植物——枸杞子，其枸杞红素含量仅0.27%，因此从枸杞子中制备枸杞红素显然不具备商业可行性。但是枸杞多糖、多酚等功能因子的活性已被证实并具备产业化条件，将枸杞红素的制备与枸杞多糖、多酚等物质相结合，实现枸杞子的综合利用，不仅实现枸杞子高值化利用，而且可提供功效明确的功能食品。