植物汤料红丝线的抗氧化及抑制亚硝化作用

张超 ，谈火群，罗晓东，庄远杯 ，谢华松，张声源 *

1. 嘉应学院医学院（梅州 514031）；2. 梅州市工程技术研究中心（梅州 514031）

人在进行生命活动时不断产生的活性氧（ROS）和自由基会使细胞和机体处于氧化应激状态（oxidative stress），这是引起衰老和产生许多疾病产生的重要因素[1]。正常生理代谢活动中，人体自身的抗氧化系统会自动消灭自由基，但当机体长期处于氧化压力状态时，便会面临诸多慢性炎性疾病的风险，如类风湿性关节炎、高血压、肥胖、动脉粥样硬化、肌肉萎缩等疾病[2]。在这种情况下，及时补充抗氧化剂来清除过多的自由基，缓解自由基对机体造成的损伤，对于许多自由基引起的衰老和相关疾病都能够很好地预防。生活中大多的化学合成抗氧化剂，如二丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）等，虽然具有很好的抗氧化能力，但同时对人体也有一定的毒性和致癌作用[3]，故其在人体中并无应用，只作为工业抗氧化防腐剂使用，加上天然抗氧化剂具有来源广泛、抗氧化活性强、易吸收和安全性高等优点，开发天然抗氧化剂越来越受到关注。

N-亚硝基化合物是一种致癌性很强的化合物，已研究的近300种N-亚硝基化合物中，90%以上具有动物致癌性，并证明N-亚硝基化合物可在体内外由其前体物胺类与硝酸盐或亚硝酸盐形成[4]。亚硝酸盐是自然界中普遍存在的一类含氮无机化合物，可作为食品添加剂应用于肉制品中，起到护色、增色、增味、防腐等作用，但亚硝酸盐是一把双刃剑，为食品加工带来效益的同时，也可因一次性摄入过量亚硝酸盐引起中毒甚至死亡[5]。另外，亚硝酸盐被人食用后，会在人体内形成亚硝胺，而亚硝胺是一种强烈致癌物质，会引起食道、胃、肝和大肠等部位的癌症[6-8]。人体从食物中摄入的亚硝胺量极少，但是形成亚硝胺的前体物质亚硝酸盐和胺类却大量存在于硝酸盐或亚硝酸盐含量较高的腌制肉制品、泡菜及变质的蔬菜等食物中，以及产生于食物在体内的代谢过程中[9]。胃是适合亚硝基化反应的有利场所，人体摄入亚硝酸盐和胺类化合物后，两者就会在胃内进行亚硝化反应，直接生成亚硝胺，所以阻断或减少亚硝胺的生成是预防亚硝胺所致癌症的有效途径[10]。

红丝线是爵床科观音草属植物观音草（Peristrophe bɑphicɑ（Spreng）Bremek）的干燥全草，又名野靛青、山蓝、红兰草、青丝线等，主要分布于印度、东南亚国家及中国南部，为广西壮族自治区特色食品——红兰酒的原料，也是东南亚及我国西南少数民族传统的食用染料植物，全草有清肺热、凉血止血、活血化瘀、消肿止痛等作用，作为一种民间草药，其常用于止咳祛痰和治咯血、跌打损伤等症[11]。据《常用中草药手册》记载，红丝线具有“淡凉，散瘀、止血，治跌打淤肿、急性扭挫伤、内伤咳血”的作用。《全国中草药汇编》中对红丝线的描述为：“甘、淡、凉。清肺止咳，散瘀止血。治肺结核咯血、肺炎、糖尿病、跌打损伤肿痛。”多项研究表明，红丝线具有多种活性成分，如生物碱、萜类、有机酸、黄酮类化合物、挥发油、脂肪族化合物及微量元素等化学物质[12-14]。红丝线是梅州客家地区常见药膳原料，口感鲜美，具清肺泻火、消肿解毒等多种功效，民间多用于小儿高热，惊风等；其药食两用的科学内涵至今尚未明确，严重制约其进一步开发利用。

就国内外来看，对红丝线的研究集中于其化学成分及药理活性、不同提取物、毒理学和生药学研究等[15-18]，杨朝竣等[19]证实红丝线中的色素具有较好的抗氧化活性，而对红丝线抑制亚硝化作用的研究却鲜见有报道。试验采用DPPH法、ABTS法和普鲁士蓝法评价红丝线提取物不同溶剂萃取部位的抗氧化作用，并在模拟人体胃液的条件下采用盐酸萘乙二胺法和α-萘胺法分别测定红丝线提取物对亚硝酸盐的清除率和对亚硝胺合成的阻断率，从而对其抗氧化能力及抑制亚硝化作用进行研究分析，以期为红丝线的进一步开发利用提供试验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红丝线干品于2018年5月购自梅州市梅江区，经嘉应学院医学院张声源副教授鉴定为爵床科观音草属植物观音草（Peristrophe bɑphicɑ（Spreng）Bremek）的干燥全草，标本存放于嘉应学院医学院天然药物标本馆。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）（美国Sigma公司）；亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、二甲胺、1-萘胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；维生素C（西陇科学有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1800型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；BT125D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；N-1100V型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；WFT-203B三用紫外线分析仪（上海精科实业有限公司）；HH-2A恒温水浴锅（常州润华电器有限公司）。

1.3 样品制备

取红丝线干燥样品2.0 kg粉碎后，90%乙醇溶液超声提取3次（45 ℃，200 W，30 min），减压浓缩后加水散开成混悬液，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取浓缩，分别制得红丝线的石油醚部位24.7 g（P-P）、乙酸乙酯部位10.3 g（P-E）、正丁醇萃部位16.5 g（P-B）、水部位86.8 g（P-W）。

1.4 体外抗氧化作用研究

1.4.1 DPPH法

DPPH自由基清除能力测定参考文献[20]，分别精密吸取100 μL不同质量浓度的样品和VC溶液，并分别加入于3.9 mL 1 mmol/mL DPPH无水乙醇溶液中，避光反应20 min，以无水乙醇溶剂做空白对照，在517 nm波长处测量其的吸光度（Ai）；测定3.9 mL 1 mmol/mL DPPH无水乙醇溶液与100 μL无水乙醇混合后在波长517 nm处的吸光度（A0）；测定3.9 mL无水乙醇溶液与100 μL样品溶液在波长517 nm处的吸光度（Aj），每个样品平行测定3 次。根据式（1）计算各样品对DPPH自由基的清除率。

1.4.2 ABTS法

ABTS自由基清除能力测定参考文献[21]，将2.45 mmol/mL过硫酸钾与7.0 mmol/mL ABTS溶液进行体积1︰1混合后避光放置16 h制备得ABTS母液，用0.01 mol/mL磷酸缓冲溶液（pH 7.4）稀释ABTS母液，得到在734 nm波长处的吸光度0.70±0.02的ABTS工作液。分别将100 μL不同质量浓度的样品和VC溶液加入3.9 mL ABTS工作液中，振荡30 s，在室温条件下放置10 min，在734 nm波长下测定其吸光度（Ai）。使用同样方法在波长734 nm处测定3.9 mL ABTS工作液与100 μL无水乙醇混合后的吸光度（A0）。同法在波长734 nm处测定3.9 mL 0.01 mol/mL磷酸缓冲溶液与100 μL样品溶液的吸光度（Aj），每个样品平行测定3次。根据式（2）计算各样品对ABTS自由基的清除率。

1.4.3 普鲁士蓝法

普鲁士蓝法的测定参考文献[22]，并做适当修改。分别精密移取2.0 mL不同质量浓度的样品和VC溶液于10 mL试管中，再分别加入2.0 mL磷酸缓冲液（2.0 mol/mL，pH 6.6）和2.0 mL 1%铁氰化钾，摇匀，于50 ℃恒温水浴20 min后取出急速冷却，再分别加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液。将上述溶液离心10 min（6 000 r/min），取上清液2.0 mL，加入1.5 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1% FeCl3混匀，静置10 min后于波长700 nm处测定吸光度，每个样品平行测定3次，吸光度越大，还原能力越强。

1.5 抑制亚硝化作用研究

1.5.1 盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐清除率

盐酸萘乙二胺法亚硝酸盐清除率的测定参考文献[23]，并做适当修改。取不同质量浓度的样品和VC溶液1.0 mL于25 mL比色管中，分别加入pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.0 mL、5 μg/mL亚硝酸钠溶液2.0 mL，充分混匀后37 ℃水浴1 h，加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，混匀，静置3～5 min，各加1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液。定容静置15 min后在波长538 nm下测定吸光度（Ai），同时测定空白对照组的吸光度A0和样品溶液对照组Aj，每个样品平行测定3次。根据式（3）计算各样品对亚硝酸盐的清除率。

1.5.2α-萘胺法测定亚硝胺合成阻断率

α-萘胺法测定亚硝胺合成阻断率参考文献[24]，并做适当改动。取不同质量浓度的样品和VC溶液5.0 mL于25 mL比色管中，分别加入pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10.0 mL、1 mmoL/L NaNO溶液1.0 mL、

21 mol/L二甲胺溶液1.0 mL，定容后37 ℃水浴1 h。取上述溶液1.0 mL于培养皿中，加入0.5% Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析仪上用波长254 nm紫外光照射15 min。取出后分别加入1%对氨基苯磺酸1.5 mL、0.1%α-萘胺1.5 mL和蒸馏水0.5 mL，摇匀后静置15 min，在最大吸收波长525 nm处测定吸光度（Ai），同时测定空白对照组的吸光度A0和样品溶液对照组Aj，每个样品平行测定3 次。根据式（4）计算各样品对亚硝胺合成的阻断率。

1.6 数据处理

试验结果所得试验数据以均数±标准差（±s）表示，通过Origin 8.5和SPSS 24.0进行处理分析，计算IC50值，采用单因素方差法进行显著性分析，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 体外抗氧化试验

2.1.1 对DPPH自由基的抑制作用

红丝线不同溶剂萃取部位对DPPH自由基的清除率测定结果及IC50见图1和表1。由图1可知，在试验浓度范围内，红丝线各萃取部位对DPPH自由基均具有一定程度的清除作用，清除率随质量浓度增大而增大，呈一定量效关系，对DPPH自由基的清除能力顺序依次为P-E＞P-B＞P-W＞P-P。据表1可知，P-E清除DPPH自由基的IC50值最低（0.052 4±0.004）mg/mL，表明红丝线清除DPPH自由基的活性物质主要集中在乙酸乙酯部位。但红丝线4个萃取部位对DPPH自由基的清除能力仍然弱于阳性对照VC（IC50=0.04±0.001 mg/mL，p＜0.05）。

图1 红丝线各萃取部位对DPPH自由基清除能力的影响

表1 红丝线各萃取部位清除DPPH自由基的IC50值

2.1.2 对ABTS自由基的抑制作用

红丝线不同溶剂萃取部位对ABTS自由基的清除率测定结果见图2和表2。由图2可知，4个萃取部位对ABTS自由基的清除能力呈现量效关系，P-E对ABTS自由基的清除能力最强，P-B与P-W对ABTS自由基的清除能力接近，清除率由高到低依次为P-E＞P-B＞P-W＞P-P。由表2可知，P-E对ABTS自由基清除能力比其他3个极性要强，但4个萃取部位对ABTS自由基的清除能力仍然弱于阳性对照VC（IC50=0.033±0.003 mg/mL，p＜0.05）。

图2 红丝线各萃取部位对ABTS自由基清除能力的影响

表2 红丝线各萃取部位清除ABTS自由基的IC50值

2.1.3 对铁离子的还原能力

通过还原力强弱评价样品抗氧化作用，由图3可知，P-E的铁还原能力最强（578.812±32.344）mmol VC/g。红丝线各提取物对铁离子的还原能力顺序依次为P-E＞P-B＞P-W＞P-P，P-E对铁的还原能力显著大于其他萃取部位，表明红丝线对铁还原能力的活性物质主要集中在乙酸乙酯部位。

图3 红丝线各萃取部位对铁还原能力的影响

2.2 体外抑制亚硝化作用结果

2.2.1 对亚硝酸盐的清除能力

据图4可知，在模拟人体胃液条件下，红丝线4个萃取部位对亚硝酸盐表现出一定程度的亚硝酸盐清除作用，且清除率在试验浓度的范围内随质量浓度增大而增强，但不同萃取部位的清除能力存在较大差异，质量浓度相同时（10 mg/mL），P-E对亚硝酸盐的清除率超过80%，显示出最强的亚硝酸盐清除作用。由表3可知，各萃取部位清除亚硝酸盐能力大小依次为P-E＞P-B＞P-W＞P-P，P-E清除亚硝酸盐的IC50值为（2.590 9±0.130）mg/mL，远小于其他部位，表明4个萃取部位中乙酸乙酯部位对亚硝酸盐的清除能力最强，其次是石油醚层，IC50值为（3.480±0.265）mg/mL，但仍大于阳性对照VC（IC50=1.480 2±0.022，p＜0.05）。

图4 红丝线各萃取部位对亚硝酸盐清除能力的影响

表3 红丝线各萃取部位清除亚硝酸盐的IC50值

2.2.2 亚硝胺合成的阻断能力

红丝线不同溶剂萃取部位对亚硝胺合成的阻断率测定结果见图5和表4。由图5可知，模拟人体胃液条件下，阻断率随浓度呈正相关。在质量浓度20 mg/mL，P-E和P-B对亚硝胺的阻断率分别达到81.65%和77.19%，大于P-E（37.29%）和P-P（22.97%），表现出良好的亚硝胺合成阻断作用。如表4所示，P-E和P-B的IC50最低，但仍大于阳性对比VC，表明红丝线阻断亚硝胺合成的活性物质主要集中在乙酸乙酯层和正丁醇层，但二者存在差异。

图5 红丝线各萃取部位对亚硝胺合成阻断能力的影响

表4 红丝线各萃取部位阻断亚硝胺合成的IC50值

3 结论

试验首次对红丝线的抗氧化、抑制亚硝化作用进行较为系统的探究，将为红丝线药材质量标准的建立、药理活性研究提供物质基础和科学依据。抗氧化和抑制亚硝化结果显示，红丝线不同溶剂萃取部位均具有一定抗氧化能力和抑制亚硝化能力。综合DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力的试验结果，4个不同极性组分抗氧化活性大小为：P-E＞P-B＞P-W＞P-P，因此从整体上看，红丝线萃取组分中，乙酸乙酯组分（P-E）的抗氧化能力最强。与此同时，综合亚硝酸盐的清除能力和亚硝胺合成阻断能力2种体系评价结果，红丝线不同极性组抑制亚硝化能力依次为P-E＞P-B＞P-W＞P-P，乙酸乙酯组分（P-E）有比较好的亚硝酸盐清除作用。因此，可以针对抗氧化和抑制亚硝化作用评价的结果，对红丝线做进一步研究，为深入开发这一梅州特色药食两用植物提供理论依据。