反复冻融辅助弱碱法提取米糠蛋白

张安宁，王晔，李照晴，孙丽慧*

大连理工大学海洋科学与技术学院（盘锦 124221）

米糠是稻谷加工过程中的副产物，通常占稻谷质量的6%～8%，却含有占稻谷约60%的营养成份及90%的人体所需营养素，有“天然营养宝库”之称[1]。米糠中包含11%～16%[2]粗蛋白，米糠蛋白与大豆蛋白接近，其氨基酸组成符合FAO/WHO推荐营养模式[3-4]，蛋白消化率达90%以上且过敏性低，因而在婴幼儿配方食品中有着广泛应用[5]。

米糠蛋白的提取方法主要包括强碱法、酶法和物理法[6-7]。酶法提取，可以保持较好的蛋白营养性和功能性，例如王晓雅等[8]利用碱性蛋白酶，在温度60℃，pH 9.5条件下提取3 h，可获得米糠的蛋白的提取率为75.42%，但酶的成本较高，后处理繁琐，该方法还适用于大规模工业化生产；物理方法简单方便，但提取效率偏低，常被用作米糠蛋白提取的辅助方法，如于雷等[9]利用超声辅助双酶法提取米糠蛋白，在功率220 W条件下超声20 min，用α-淀粉酶和蛋白酶进行酶解，在最优条件下米糠蛋白的提取率可达80.83%；碱提取法简单经济，且提取率高，如Chen等[10]在温度25 ℃，pH 12条件下提取1 h，米糠蛋白提取率为82.50%，然而在强碱条件下蛋白变性程度高，而且还会加速美拉德反应，影响蛋白的营养价值。

反复冻融是一种较温和的破壁方式，主要通过细胞内冰粒形成和残余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，如此反复达到破壁的目的。试验采取反复冻融辅助弱碱法（在pH 9.5条件下）提取米糠蛋白，并对其功能特性进行分析，为米糠蛋白进一步利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜米糠（辽宁恒际生物科技有限公司）；蛋白相对分子质量Marker、牛血清白蛋白（生工生物工程（上海）股份有限公司）；其他化学药品均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

H1850台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；UV-5800紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；KDN-04C凯氏定氮仪（上海洪纪仪器设备有限公司）；FD-1C-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；DYY-8C型电泳仪及DYCZ-24DN电泳槽（北京六一仪器厂）；Zeta sizer Nano ZS-纳米粒度与ZETA电位分析仪（英国马尔文仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白的制备

新鲜米糠通过80目筛子剔除杂质，使用正己烷按料液比1︰10（g/mL）脱脂。脱脂米糠使用弱碱（氢氧化钠溶液，pH 9.5）按料液比1︰10～1︰25（g/mL）浸泡，并将其放入-20 ℃环境下进行冷冻4 h，于45℃条件下解冻，反复冻融1～6次，每次冻融后都使用0.1 mol/L浓度的NaOH或HCl调节料液pH，使其维持在9.5；处理好的料液于35～50 ℃条件下进行碱提1～3 h（pH 9.5），边提取边搅拌，以4 500 r/min离心20 min分别得残渣和上清液，残渣水洗1次后离心，合并上清液；上清液调至pH 4.5进行酸沉，以4 500 r/min离心20 min，对蛋白沉淀收集并进行真空冷冻干燥回收得到米糠蛋白。

1.3.2 提取工艺的优化

1.3.2.1 单因素试验

分别以冻融次数、料液比、提取时间和提取温度4个因素进行单因素试验，以米糠蛋白提取率为衡量指标，具体方案如表1。

表1 蛋白提取条件的单因素试验

1.3.2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验设计选出反复冻融辅助弱碱法提取米糠蛋白的最优条件。

表2 正交试验的因素与水平

1.3.3 分析测定方法

1.3.3.1 蛋白含量测定

使用采用凯氏定氮法测定脱脂米糠中粗蛋白含量及所提取的米糠蛋白产品纯度，采用考马斯亮蓝法测定提取液中米糠蛋白含量，提取率按式（1）计算。

1.3.3.2 米糠蛋白的性质

1) 持水性和持油性

米糠蛋白用去离子水/大豆油稀释到10 mg/mL并充分混合，于5 000 r/min的转速下离心30 min，小心移除上清液。持水/油性（WHC/OHC）按式（2）计算[11]。

2) 起泡性和泡沫稳定性

使用去离子水配制100 mL 1 g/100 mL米糠蛋白溶液，用高速分散均质机在1 000 r/min均质2 min，迅速倒入量筒记录泡沫体积V1，静置30 min后，再次测量泡沫体积V2，起泡性（FC）和泡沫稳定性（FS）按式（3）和（4）计算[12]。

3) 乳化性及其稳定性

使用0.05 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液中配制1 g/100 mL米糠蛋白溶液，取75 mL蛋白溶液与25 mL大豆油充分混合，在乳化机10 000 r/min转速下乳化2 min后立刻从烧杯底部吸取20 μL乳状液，加入5 mL 0.1% SDS溶液混合。以浓度为0.1% SDS溶液为空白样品，测定500 nm下的吸光度。待乳化液放置10 min后，从烧杯底部吸取乳状液（与0 min取样点位置相同），按上述方法测定吸光度[13]。乳化活性EAI和乳化稳定性ES按式（5）和（6）计算。

式中：T=2.303；N为稀释倍数，250；c为乳化液未形成前蛋白质溶液的质量浓度，g/mL；Φ为乳化液中油相体积分数，0.25；A0和A10分别为0和10 min时吸光度；t为间隔时间，10 min。

4) 蛋白溶解度

称取0.1 g米糠蛋白样品加入到10 mL去离子水中，将pH分别调至2～11，室温下磁力搅拌1 h，在3 000 r/min转速下离心20 min，收集上清液，测其蛋白含量，蛋白溶解度按如式（7）计算[14]。

5) 米糠蛋白Zeta电位滴定曲线

使用去离子水配制2 mg/mL米糠蛋白溶液，采用0.5 mol/L NaOH或0.5 mol/L HCl在持续搅拌条件下滴定蛋白溶液，使其从pH 10.0逐渐降低至pH 2.0，测定不同pH下蛋白微粒Zeta电位。比色池采用规格为1 cm的聚苯乙烯池，采用一对0.45 cm2铂电极，间距为0.4 cm。测定温度为25 ℃，温度平衡时间2 min[15]。

6) 米糠蛋白亚基分布及其相对分子质量的测定

米糠蛋白亚基分布及其相对分子质量的测定采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法。称取10 mg米糠蛋白样品溶于10 mL去离子水中，沸水浴加热5 min。分离胶与浓缩胶浓度分别为15%和5%，上样量10 μL。染色采用0.25%考马斯亮蓝R-250溶液，脱色采用高甲醇的醋酸溶液。

2 结果与分析

2.1 米糠蛋白的制备

图1所示，对试验中反复冻融次数、料液比、提取时间和提取温度进行单因素试验优化，优化结果为冻融4次、料液比1︰15（g/mL）、提取时间120 min、提取温度45 ℃。在单因素试验基础上，以米糠蛋白提取率为评价指标，利用正交试验选出反复冻融辅助弱碱法的最佳提取条件，结果如表3。根据极差分析可知影响提取率的主次因素为冻融次数＞提取温度＞提取时间＞料液比，最佳提取条件为A2B2C3D2，即冻融4次、提取温度45 ℃、提取时间150 min、料液比1︰15（g/mL）。

在最优条件下使用反复冻融辅助弱碱法提取米糠蛋白，结果如图2所示。使用反复冻融辅助弱碱法制备米糠蛋白提取率和纯度分别为63.07%和66.61%，与等同条件下只采用弱碱法制备米糠蛋白相比，提取率提高11.49%，而蛋白纯度基本没有明显改变。

2.2 米糠蛋白的性质测定

2.2.1 持水性和持油性

蛋白产品应用在食品配方中时一般都要求具有高持水性和高持油性，如在蛋糕、香肠等加工食品。如图3所示，与单独使用弱碱法提取米糠蛋白相比，冻融辅助弱碱提取蛋白的持水性略有降低，而持油性基本没有改变。Aletor等[16]认为，蛋白持水性在1.49～4.72 g/g范围内，可应用于各种黏性食品中。试验采用冻融辅助弱碱提取的米糠蛋白的持水性为3.58 g/g，表明其仍具有较好持水性。

2.2.2 泡沫特性

蛋白泡沫特性反映其降低水-空气界面表面张力的能力，这与蛋白分子结构密切相关，且在食品工业中形成泡沫可以增加产品的体积。试验结果如图4所示，蛋白样品的泡沫特性并无区别，表明反复冻融辅助弱碱提取米糠蛋白并未对其发泡能力和泡沫稳定性产生不良影响。

图1 不同因素对米糠蛋白提取率的影响

表3 正交试验结果

图2 提取方式对米糠蛋白提取率和纯度影响

图3 提取方式对米糠蛋白持水/油性的影响（WHC持水性；OHC持油性）

图4 提取方式对米糠蛋白持水/油性和泡沫特性的影响（FC起泡性；FS泡沫稳定性）

2.2.3 乳化特性

乳液的形成是由于蛋白结构中存在着一些疏水基团和亲水基团，蛋白的乳化特性是其在食品工业中用作表面活性剂的一个重要参考，而牛血清白蛋白（BSA）则常被用作比较蛋白乳化性能的参考标准[17]。从图5可以看出，与单独使用弱碱提取米糠蛋白相比，冻融辅助弱碱法提取蛋白的乳化性及其稳定性并无明显差异。与BSA相比，2种方式提取的米糠蛋白样品均有着较好的乳化稳定性，但乳化性则差于BSA。

图5 提取方式对米糠蛋白乳化性及其稳定性的影响（EAI乳化性；ES乳化稳定性）

2.2.4 蛋白溶解度及Zeta电位滴定曲线

如图6所示，2种方式提取的米糠蛋白样品表现出相同的蛋白溶解曲线，即曲线的形状类似于“U”形，在pH 4～5（等电点附近）溶解度最低，pH低于4或高于5时，蛋白溶解度缓慢提高，但pH大于10时，溶解度又出现下降趋势，这可能与高浓度碱性条件下蛋白的变性有关。

Zeta电位是带电颗粒表面剪切层的电位，是表征蛋白在溶液中的稳定性的重要指标[18]。从图7中可以看出，2种方式提取的米糠蛋白样品Zeta电位滴定曲线并无明显区别。单独使用弱碱提取的米糠蛋白在pH 4.36时Zeta电势为0，为其等电点；使用冻融辅助弱碱提取的米糠蛋白在pH 4.31时Zeta电势为0，为其等电点。蛋白在等电点溶解度最低，试验结果与图5中米糠蛋白溶解度的变化一致。

图6 不同方式提取的米糠蛋白溶解度

图7 不同方式提取的米糠蛋白Zeta电位滴定曲线

2.2.5 蛋白亚基分布及其相对分子质量

图8 不同方式提取的米糠蛋白SDS-PAGE图

SDS-PAGE凝胶电泳常被用来研究蛋白中亚基的分布变化及相对分子质量测定[19]。对米糠蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白亚基分布如图8所示。可以看出，2种不同提取方式得到的米糠蛋白电泳图谱并无明显区别，可见反复冻融辅助弱碱法提取米糠蛋白对其亚基分布及其相对分子质量基本没有影响。这2个蛋白样品的亚基相对分子质量分布主要分为3个区域，即42.7～66.2 kDa；31.0～42.7 kDa和＜31.0 kDa。

3 结论

以米糠为原料，在单因素试验基础上，采用正交试验对反复冻融辅助弱碱法提取米糠蛋白的工艺进行了优化，得到的最优条件为：反复冻融4次、料液比1︰15（g/mL）、提取温度45 ℃及提取时间150 min。在此条件下进行验证试验，蛋白的提取率为63.07%，纯度为66.61%。该方法制备的米糠蛋白的特性良好，其蛋白泡沫特性、持油性、乳化稳定性、溶解度、Zeta电位滴定曲线及蛋白亚基相对分子质量分布与单独利用弱碱法提取的米糠蛋白样品对比并无明显差异，而持水性略有降低。研究表明冻融辅助弱碱提取米糠蛋白能明显提高提取率，且该方法操作简单，不需要复杂或昂贵的设备，是一种切实可行的米糠蛋白提取方法。