响应面优化微波辅助离子液体提取葛根素的工艺
2020-11-02黎莉于德涵苏适王广慧
黎莉，于德涵，苏适，王广慧
绥化学院食品与制药工程学院（绥化 152061）
葛根[Puerɑriɑ lobɑtɑ（Willd.）Ohwi]为豆科植物野葛的干燥根[1-2]，我国葛根植物资源丰富，具有数量、质量等经济价值的优势，是我国传统的天然中药材[3]，富含淀粉、氨基酸、植物蛋白，黄酮类物质和维生素等成分。葛根中主要活性成分是葛根素，其化学本质属于异黄酮类化合物[4]具有较高的药用价值和保健作用，研究表明葛根素对心脑血管疾病[5]、抗炎症[6]、肥胖[7]和微循环障碍[8]等都具有一定的治疗和改善效果。因此，葛根素的含量可以作为葛根提取物的质量评价指标。
传统提取葛根素的方法存在耗时长、工艺复杂、溶剂用量大、纯化难等缺陷。微波辅助萃取法是提取天然产物的有效方法，微波具有较强的穿透和加热能力，能促进细胞内部大量产热导致细胞壁破裂，显著提高细胞内成分的溶出速度，缩短提取时间，产品易纯化，并能有效保护天然产物功效[9]。传统的微波萃取法一般选用甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙醚等有机溶剂，传统溶剂有较强的挥发性或毒性，给天然产物的提取和利用带来了极大的不便和环境污染问题。离子液体（ionic liquid）是一种新型的绿色溶剂，与传统有机剂相比，溶解能力强，热稳定性好、化学性质稳定、不易挥发且可重复利用[10-11]，能溶解纤维素并破坏植物细胞壁，并能很好的吸收微波辐射。因此，研究利用离子液体结合微波辅助提取葛根中的葛根素，通过响应面试验优化葛根素的提取工艺。目前，葛根的应用主要集中于食品原料的粗开发，产品附加值较低，制约了葛根资源的开发和利用，针对葛利用提供一个高效、快捷的提取方法，并能保持葛根素的活性和产品纯度，为合理开发葛根资源提根素的提取方面的研究较少，该研究为葛根素的有效供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
葛根：北京同仁堂参茸中药制品有限公司。
葛根素标准品，纯度98%，北京中科质检生物技术有限公司；[Bmim]Cl（1-正丁基-3-甲基咪唑氯），纯度97%，国药试剂有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析纯，国药试剂有限公司；抗坏血酸，分析纯，国药试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.1.2 主要仪器与设备
MKX-E1微波萃取仪，青岛迈可威微波创新科技有限公司；TDZ5-WS离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；DZF-6050E真空干燥箱，无锡玛瑞特科技有限公司；UV1800PC紫外分光光度计，上海向帆仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线
根据文献[12]方法，称取葛根素对照品5 mg，加少量乙醇溶解并加蒸馏水于50 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mg/mL的葛根素标准溶液。移取标准溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.5和2.0 mL分别置于10 mL容量瓶，用95%乙醇定容至刻度线。在250 nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、质量浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到葛根素标准曲线方程为：X=6.820 6Y+0.210，R2=0.996 8。
1.2.2 葛根素的提取工艺及含量测定
葛根洗净→60 ℃烘干→粉碎→过60目筛→称取1.0 g葛根粉→微波辅助[Bmim]Cl的水溶液提取（40℃）→葛根素提取液离心（30 min，3 000 r/min）→取上清液→测定葛根素含量。
式中：R为葛根素提取率，%；C为测得质量浓度，μg/mL；V为定容体积，mL；n为稀释倍数；M为原料质量，g。
1.2.3 单因素试验方法
单因素试验依次考察离子液体浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mol·L-1）、料液比（1︰5，1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30 g·mL-1）、提取时间（2，4，6，8，10和12 min）、微波功率（100，200，300，400，500和600 W）4个因素对葛根素提取率的影响结果，平行进行3次试验，在250 nm处测定吸光度，计算葛根素提取率。1.2.4 响应面优化试验方法
结合单因素试验结果，以葛根素的提取率为响应值（Y），进行Box-Behnken试验设计。选取离子液体浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取温度（D）4个变量，设计响应面试验，具体因素与水平设计见表1。
表1 微波辅助离子液体提取葛根素Box-Behnken因素设计与编码
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 离子液体浓度对提取率的影响
固定微功率350 W、提取时间 10 min、料液比1︰15 g/mL，分别在不同离子液体浓度下进行提取，确定响应面试验离子液体浓度的优化范围，结果见图1。
随着离子液体浓度的增加，葛根素提取率明显升高，当[Bmim]Cl浓度高于1.0 mol/L时，葛根素提取率开始下降。可能是离子液体浓度低，溶剂与葛根素类化合物接触的概率小，故提取率低；但[Bmim]Cl浓度不断增加会导致溶剂体系的黏度增大，降低溶剂渗透到植物组织的能力，阻碍了葛根素在溶液中的扩散[13]。因此，选择离子液体浓度0.8，1.0和1.2 mol/L作为响应面试验考察条件。
图1 离子液体浓度对提取率的影响
2.1.2 微波功率对提取率的影响
固定离子液体浓度1.0 mol/L、提取时间 10 min、料液比1︰15 g/mL，分别在不同微波功率下进行提取，确定响应面试验微波功率的优化范围，结果见图2。
图2 微波功率对提取率的影响
随着微波功率的增大，葛根素的提取率先增大后降低，当微波功率达到400 W时，葛根素提取率达到最大值，随后开始下降。可能是微波功率过小，无法充分破坏葛根植物，葛根素不能完全释放出来；微波功率过高也会加速植物细胞内其他杂质的溶出，葛根素提取率降低[14]。因此，微波功率选择350，400和450 W作为响应面试验考察条件。
2.1.3 料液比对提取率的影响
固定离子液体浓度1.0 mol/L、微波功率400 W、提取时间10 min，分别在不同料液比下进行提取，确定响应面试验微波功率的优化范围，结果见图3。
葛根素提取率随着料液比的增长而显著增加，当料液比为1︰20（g/mL）时，葛根素的溶解度和溶出速度达到最大，随后开始下降。可能是料液比过小，提取液粘度较大，不能保证葛根素转移到提取液中。料液比增大，大量溶剂会吸收一定的微波辐射，降低了细胞内葛根素溶出量[15]。因此，料液比选择1︰15，1︰20和1︰25 g/mL作为响应面试验考察条件。
2.1.4 提取时间对提取率的影响
固定离子液体浓度1.0 mol/L、微波功率400 W、提取时间10 min，分别在不同料液比下进行提取，确定响应面试验提取时间优化范围，结果见图4。
图3 料液比对提取率的影响
图4 提取时间提取率的影响
提取时间在2～12 min时，葛根素提取率随着时间的延长迅速增加，提取8 min时，提取率达到最大值，随后开始下降。可能是提取时间短，葛根中有效成分不能充分溶出；提取时间过长，微波产生高温破坏有效成分[16]。因此，微波时间选择6，8和10 min作为响应面试验考察条件。
2.2 响应面优化葛根素提取率的最佳工艺参数
2.2.1 回归模型建立与显著性检验
对表2数据进行二次多项式回归拟合，获得葛根素提取率得与离子液体浓度、微波功率、料液比、提取时间4个因素的回归方程为：Y=+4.22+0.068A+0.024B+0.065C-0.030D-7.250×10-3AB+3.500×10-3AC-4.75×10-3AD+0.018BC+0.023BD-1.000×10-3CD-0.36A2-0.16B2-0.075C2-0.22D2。
由表3可知，根据回归方差分析显著性检验，p＜0.000 1，说明回归模型方程达到极显著水平；失拟值p=0.055 1＞0.05，不显著；回归模型的决定性系数R2=0.988 8，模型校正系数R2Adj=0.977 6，说明回归方程与试验拟合良好，误差小。由表3中F值可知，A和B对葛根素提取率影响极显著（p＜0.01），C和D为模型显著因素（p＜0.05）；交互项AB和BD对葛根素提取率影响显著（p＜0.01）；二次项A2、B2、C2和D2对葛根素提取率影响极显著（p＜0.01），其余各项对葛根素得率影响均不明显。方差分析可知，即各因素对葛根素提取率影响的大小顺序为：离子液体浓度＞料液比＞微波功率＞提取时间。因此，可用该模型分析和预测葛根中葛根素的提取工艺。
表2 试验设计与结果
表3 微波辅助离子液体提取葛根素回归方程方差分析
2.2.2 数学模型及响应面分析[17]
采用Design Expert 8.0软件对离子液体浓度（A）、微波功率（B）、料液比（C）和提取时间（D）之间交互作用的关系进行分析。响应曲面和等高线的平缓与陡峭程度能够直观体现出反映各因素之间相互作用的强弱，提取参数交互作用对葛根素提取率的响应曲面见图5～图10。
由图5～图10可知，随着离子液体浓度、微波功率、料液比和提取时间的增大，葛根素的提取率先升高后降低，影响葛根中的葛根素提取率的各交互作用因素顺序为AD＞AB＞BD＞BC＞CD＞AC。
图5 离子液体浓度和微波功率对葛根素提取率的影响
图6 离子液体浓度和料液比对葛根素提取率的影响
图8 微波功率和料液比对葛根素提取率的影响
图9 微波功率和提取时间对葛根素提取率的影响
图10 提取时间和料液比对葛根素提取率的影响
2.2.3 验证试验
通过Design Expert 8.0对试验模型进行分析，求解方程得到最佳提取工艺为：离子液体浓度1.02 mol/L，提取时间7.87 min，料液比1︰21.97（g/mL），微波功率度407.92 W，理论预计值4.227%。考虑操作条件，将实际工艺参数调整为离子液体浓度1.0 mol/L，提取时间8 min，料液比1︰22（g/mL），微波功率度400 W，在此条件下葛根素提取率的实际值为4.201%，与软件模拟值预测误差为0.61%，实际与模型符合良好，因此，证实了模型的有效性。
3 结论与讨论
试验研究采用微波辅助离子液体提取葛根中的葛根素。在单因素试验的基础上，运用响应面法对葛根素提取条件进行优化，建立回归模型方程，得到最佳提取工艺参数为：离子液体浓度1.0 mol/L，提取时间8 min，料液比1︰22（g/mL），微波功率度400 W。此条件下葛根素的提取率为4.201%，较文献已报道的提取率有较大提高[18]。与传统溶剂提取方法相比，离子液体的极性可控，可对样品高效、充分的萃取，所需溶剂少，离子液体可重复利用，是一种快速高效提取葛根素的理想方法。
