红阳猕猴桃果酒加工中果胶酶酶解工艺

韦婷，何靖柳，刘翔，张恒，杨冬雪，程金权

1. 雅安职业技术学院药学与检验学院（雅安 625000）；2. 四川省食品发酵工业研究设计院（成都 611130）

猕猴桃被誉为“果中之王”“天然植物维生素C”。红阳猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属，是四川省苍溪县野生红肉猕猴桃中选育出来的红肉新品种，其果肉细嫩多汁，横截面呈现放射性红黄色条纹，十分美观，且具有丰富的维生素C等，深受人们喜爱。在四川省大面积种植，形成苍溪县、都江堰市、蒲江县等地为中心，以雅安市、安县、北川县、汶川县等地为辐射区的猕猴桃产业带。猕猴桃产量高又是呼吸跃变型水果，不易贮藏运输，各地都在积极探索果品深加工技术。因为猕猴桃含糖分高，成熟后柔软多汁，并且富含钙、铁、钾等多种矿物质及17种氨基酸[1]，加工成果酒后酒精度数不高、成分丰富，是近年研究较多的产品形式，并且已经工业化生产。但在果酒生产贮藏中因原料中果胶、单宁、奎宁酸、酒石酸等含量高，使得产品存在出汁率低、酸涩味重及装瓶后沉淀浑浊现象[2-4]，严重影响猕猴桃果酒的品质和企业效益。根据果胶酶应用于猕猴桃酒的研究报道，证实果胶酶能有效分解果实中果胶质，从而提高果汁的出汁率[5-9]。但果胶酶应用于红阳猕猴桃的报道还较少，以四川雅安市出产红阳猕猴为原料，探索果胶酶在红阳猕猴桃果酒加工中对出汁率、原酒感官、酒精度、澄清度等方面的影响，为红阳猕猴桃果酒的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与试剂

红阳猕猴桃（雅安市雨城区）；优质白砂糖（蔗糖分≥99.6%，雅安市吉选超市）；发酵菌种GT-2（实验室自行筛选鉴定保藏）；果胶酶（食品级，酶活力单位＞50 000 U/g，河南万邦实业有限公司）；浓盐酸（含量≥36.0%，四川西陇化工）；氢氧化钠（成都科龙化工）；葡萄糖（天津市致远化学试剂）；无水硫酸铜（成都科龙化工）；酒石酸钾钠（成都科龙化工）。试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

猕猴桃清汁培养基[2]：成熟红阳猕猴桃去皮破碎榨汁，按20 mg/L比例加入果胶酶于40 ℃下酶解2 h，加入白砂糖调整糖度至200 g/L，115 ℃高压灭菌15 min。

1.2 主要仪器设备

YXQ-LS-100S11型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BSC-1600ⅡA2型生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；ZWYR-2012C型气浴恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；VAL-3N型酒精比重计（杭州汇尔仪器设备有限公司）；LB32T型手持糖度折光仪（广州市速为电子科技有限公司）；ME204E/02电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；UV-1601型分光光度计（北京瑞利分析仪器）；雷磁DZ-2型自动电位滴定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 果酒工艺流程

红阳猕猴桃→挑选→清洗→破碎压榨→果胶酶酶解→过滤→成分调整→灭菌→接种酵母→主发酵→后发酵→陈酿→灭菌→成品

1.3.2 工艺关键条件

1) 原料及处理

选用无病害，八成熟，雅安市雨城区所产红阳猕猴桃。果实80～120 g，果实可溶性固形物含量13%～15%，研究多以去皮果肉为原料，考虑工业化生产实际情况，全部以带皮果实为原料。将原料清洗沥干，打浆混匀，置于带棉塞灭菌三角瓶中。

2) 果胶酶配制及酶解

精确称量果胶酶2 g，用4～5倍40～50 ℃温水溶解后，加入40～50 ℃温水稀释定容，配制成1%（10 mg/mL）溶液，放置备用[5]。用移液管吸取不同量的果胶酶液加入猕猴桃果浆中，于不同温度水浴锅中保温酶解不同时间。酶解结束后用300目滤网过滤取汁，调整成分，分装于250 mL三角瓶。

3) 菌种制备

在生物安全柜内，将GT-2从斜面保藏管取出，接种到用白砂糖调整糖度200 g/L灭菌猕猴桃清汁液体培养基，置于气浴恒温振荡器中培养，设置转速150 r/min，温度28 ℃，培养72 h后，镜检确认无杂菌污染，生长良好后按体积分数5%接种到酶解后的猕猴桃原料中。

4) 前发酵

将不同酶解处理的酶解液置于22 ℃恒温培养箱中发酵7 d。

5) 后发酵

前发酵完成后用400目滤网过滤装瓶，置于15 ℃下后发酵30 d。

1.3.3 酶解温度对出汁率和原酒品质的影响

1) 宽范围酶解温度试验

将猕猴桃压榨破碎成全果浆后混匀，称取6份150 mL样品分别置于250 mL带棉塞的灭菌三角瓶，固定添加果胶酶添加量80 mg/L，酶解时间120 min，选择20，30，40，50，60和70 ℃[5]较宽温度范围下进行酶解，酶解完成立即榨汁过滤计算出汁率。滤液用白砂糖调整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒温培养箱发酵7 d，过滤，进行原酒感官评价。出汁率按照式（1）进行计算，原酒感官按照表1进行评分。

表1 红阳猕猴桃果酒原酒感官评分表

2) 细化温度区间试验

通过宽范围试验以后，发现60 ℃酶解后出汁率最高，细化温度区间，以45，55，60，65和75 ℃重复上述步骤，确定单因素下最佳酶解温度。

1.3.4 酶添加量对出汁率和原酒品质的影响

1) 宽范围酶添加量试验

将猕猴桃压榨破碎成全果浆后混匀，称取5份150 mL样品分别置于250 mL带棉塞的灭菌三角瓶，固定酶解温度60 ℃，酶解时间120 min，选择40，60，80，100和120 mg/L[4,10]较宽温度范围下进行酶解，酶解完成立即榨汁过滤计算出汁率。滤液用白砂糖调整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒温培养箱发酵7 d，过滤，进行原酒感官评价。

2) 细化酶添加量试验

通过宽范围试验以后，发现100 mg/L酶添加量下出汁率最高，细化酶添加量区间，以90，100，110，120和130 mg/L重复上述步骤，确定单因素下最佳酶添加量。

1.3.5 酶解时间对出汁率和原酒品质的影响

1) 宽范围酶解时间试验

将猕猴桃压榨破碎成全果浆后混匀，称取5份150 mL样品分别置于250 mL带棉塞的灭菌三角瓶，固定酶解温度60 ℃，果胶酶添加量100 mg/L，通过文献参考[5,8,11]并考虑猕猴桃果浆品质保持和生产效率，选择40，80，120，160和200 min较宽时间范围下进行酶解，酶解完成立即榨汁过滤计算出汁率。滤液用白砂糖调整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒温培养箱发酵7 d，过滤，进行原酒感官评价。

2) 细化酶解时间试验

通过宽范围试验以后，发现酶解时间与出汁率呈波浪状关系，细化酶解时间区间，以40，60，80，100，120，140和160 min重复上述步骤，确定单因素下最佳酶解时间。

1.3.6 酶解正交试验

预试验做过静置酶解和摇床酶解（50 ℃，加酶量40 mg/L，空气摇床120 r/min，酶解150 min）对比，发现静置酶解的出汁率和原酒感官均优于摇床酶解，所以酶解方式选择静置酶解。预试验设计调整酶解到最佳pH范围，但通过文献分析和实测猕猴桃果桨的pH，认为猕猴桃果浆pH 3.5，本身就在果胶酶提高出汁率[12-13]、提高发酵风味[8,14]和提高发酵液澄清度[5,15]各指标较理想的pH范围（pH 3.3～4.5），另外猕猴桃酸度已经较高，其果酒制作中的关键技术之一就是降酸处理，不适合人为加入酸度调节剂，所以和孙强等[12]，选择以红阳猕猴桃自然酸度进行酶解。最终选择酶解温度（A）55，60和65 ℃，果胶酶添加量（B）100，110和120 mg/L，酶解时间（C）100，120和140 min，进行3因素3水平的正交试验，以出汁率和感官评分的综合得分率作为评价指标。

1.3.7 正交结果验证及原酒指标检测

按照正交试验所得的最佳酶解组合进行酶解，接种5%的GT-2菌液，于22 ℃恒温培养箱中发酵7 d。做2个平行验证出汁率和原酒感官评分，检测原酒中残糖（总糖）、酒精度、总酸含量和澄清度；同时做2个不酶解的样品平行，做相同的指标检测，进行对比。酒精度测定，采用酒精计法[16]；残糖测定，采用菲林试剂法[17]；总酸（以酒石酸计）测定，采用电位滴定法[18]；以蒸馏水为参比，用紫外分光光度计于680 nm[19]处测过滤后静置24 h的透光率反映原酒的自然澄清度。

2 结果与分析

2.1 酶解温度对出汁率和原酒品质的影响

根据1.3.3的步骤（1）和步骤（2）试验所得数据作表2和图1。

由表2和图1可知，红阳猕猴桃全果浆的出汁率在20～60 ℃温度范围内，呈逐渐上升趋势，60 ℃达到最高值82.58%，随着温度继续上升，出汁率开始小幅度下降；总体来说50～65 ℃之间，出汁率均在81.5%以上，差别不大。说明果胶酶酶解红阳猕猴桃浆的适宜温度在50～65 ℃，继续升高温度，对出汁率没有更大的贡献。从酶解液发酵后的原酒感官来看，酶解温度较低时，如20～30 ℃时，原酒香气保留较好，整体评分还高于40～50 ℃，但低温酶解对原酒酸涩滋味改善很小；滋味改善较突出和感官评分较高是在55～65 ℃区间，感官评价最优的酶解温度也是60 ℃，得分在70分。但温度高于60 ℃，原酒感官开始劣变，75 ℃酶解的发酵液感官评分降低显著。可以看出酶解温度60℃，红阳猕猴桃果桨出汁率和感官均最优。分析原因应是60 ℃下，果胶酶能有效将果汁中的果胶水解，并且会加快单宁的溶出[20]和沉淀[21]，提高其稳定性，减轻涩味；但温度再升高，使原料的风味和营养物质分解挥发程度加大，不利于果酒保持品质。

表2 不同酶解温度原酒的感官评价

图1 不同酶解温度出汁率

2.2 酶添加量对出汁率和原酒品质的影响

根据1.3.4的步骤（1）和步骤（2）试验所得数据作表3和图2。

由表3和图2可知，果胶酶添加量40～120 mg/L时，与出汁率成正比，果胶酶添加量120 mg/L时，出汁率达到最高，为82.21%，果胶酶添加量100～130 mg/L时，出汁率均较高，在80%以上。结果表明，果胶酶添加量在一定范围内与猕猴桃果汁出汁率成正相关，但是不能无限制增加果胶酶含量，一是因为有拐点存在；二是有研究显示果胶酶的添加会增加果酒中甲醇[22]含量；三是增加生产成本。从感官指标来看，40 mg/L果胶酶添加下，原酒的色泽橘红明艳、香气丰富，滋味典型，提高原酒感官评分；但是气味和滋味中都带有明显涩味，缺陷明显。分析应为果汁中单宁没有充分溶出和沉淀。果胶酶添加量60～130 mg/L时，感官指标呈正态分布，果胶酶添加量100 mg/L时，原酒色泽橘红、澄清，果香怡人，滋味微酸但无涩味，感官评分最高88分。果胶酶添加量130 mg/L时，原酒感官明显劣变。因此，以出汁率为指标，果胶酶添加量120 mg/L最优，以感官评价为指标，果胶酶添加量100 mg/L最优。

图2 不同果胶酶添加量出汁率

2.3 酶解时间对出汁率和原酒品质的影响

根据1.3.5的步骤（1）和步骤（2）试验所得数据作表4和图3。

由表4和图3可知，试验时间内，出汁率呈波浪上升状态，酶解时间60 min达到第1个波峰，出汁率81.45%；酶解时间120 min时达到第2个波峰，出汁率82.93%；酶解时间200 min时出现最高值，出汁率83.59%。总体来看，酶解时间越长，酶解越充分，出汁率越高。从感官指标来看，酶解40 min，原酒的颜色最为红艳明亮、澄清，但是气味和滋味中涩味明显，所以感官得分偏高但不是最高。酶解时间60～200 min，感官得分率呈正态分布，酶解时间120 min下，感官得分最高，为88分。酶解时间200 min时，虽然出汁率最高，但是由于果浆中单宁、苹果酸等涩味物质溶出过多，使得原酒感官涩味很重，降低感官评分。因此，最佳酶解时间120 min。

表4 不同酶解时间原酒的感官评价

图3 不同酶解时间出汁率

2.4 正交试验结果及分析

通过对表5和表6的分析可知，各因素对综合评分的影响大小A＞B＞C，即酶解温度＞酶添加量＞酶解时间。得到最优方案为A2B3C3，即60 ℃，酶添加量120 mg/L，酶解140 min的组合最优。其中，因素A酶解温度对酶解综合评价指标有显著性影响。分析应为适当温度下，随着酶解时间延长，可溶性单宁不断溶出[20]；果胶酶，主要是聚半乳糖醛酸酶[23]可以更有效地水解果汁中的果胶物质以及多糖，使果胶黏度降低，果汁中的单宁失去果胶的保护作用而与其他胶体共同沉淀[22]；不仅提高出汁率，也降低果酒中的涩味。另外，适宜温度加上果胶酶作用，是否能降低猕猴桃汁中有机酸研究未见报道，但有研究表明两者的协同作用能降低山楂汁酸度[24]，试验从感官评价和总酸测定上也发现对猕猴桃果酒有降酸的作用，但具体影响还需进一步研究。

表5 L9(33)正交试验设计与结果

表6 方差分析

2.5 正交结果验证及指标测定

按正交试验得到的最佳工艺进行酶解验证，将出汁率、酶解后发酵的原酒和未酶解直接发酵的原酒进行各项指标检测，结果列于表7和表8。

数据对比来看，是否酶解对红阳猕猴桃原酒的残糖和酒精度基本没有影响，这2个指标主要还是与起始糖度和菌种发酵能力有关；对总酸有一定降低作用；对果酒澄清度有较大提高；同时酶解对出汁率和原酒感官的贡献很明显，出汁率平均提高16%，感官得分率平均提高7%，达到并且提高主要在口感滋味方面，这对于生产企业降低生产成本、提高市场竞争力都具有积极意义。

表7 最佳酶解和未酶解发酵原酒指标对比

表8 最佳酶解和未酶解发酵原酒指标对比

3 结论

通过酶解温度、酶添加量、酶解时间等单因素试验及正交试验探索果胶酶在红阳猕猴桃果酒加工中对出汁率、感官评价的影响。结果表明，酶解温度对酶解后出汁率和原酒感官评价的综合影响最显著，酶添加量和酶解时间也是工艺中要调控的重要因素。酶解pH以猕猴桃自然pH较适宜，酶解以静置方式为佳。试验证明，以红阳猕猴桃为原料发酵果酒，最佳酶解工艺为：自然pH 3.5，静置状态下，酶解温度60 ℃、添加酶量120 mg/L、酶解时间140 min。该工艺下发酵的红阳猕猴桃果酒与未酶解样品相比，出汁率平均提高16%，达到81.17%；感官得分率平均提高7%，得分率达到82%，并且颜色、香气、口感滋味方面更加协调无明显缺陷。同时总酸含量降低，自然澄清度增加，残糖和酒精度与未酶解的样品无明显区别，这对于生产企业降低生产成本、提高市场竞争力都具有积极意义。