栀子根茎枝不同部位药效物质基础研究*

苏志坚 黄智锋 杨成梓 陈 鸣 唐金模 陈雪梅 彭连共

栀子根为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥根，亦称栀子花根，主产于湖南、浙江、福建、江西等省。民间别称山里黄根、黄枝根、山枝根、三枝根等。《中华本草》载：“栀子根主治黄疸型肝炎、痢疾、胆囊炎、感冒高热、吐血、衄血、尿路感染，尚可用于治疗肾炎水肿、乳腺炎、风火牙痛、疮痈肿毒、跌打损伤等”[1,2]。民间广泛用于黄疸性肝炎、感冒高热、出血吐血等病症的治疗。栀子根在我院使用较为广泛，在我院肝病中心临床诊疗中得到了较为充分的应用，是肝病中心的特色用药，其疗效得到了充分的肯定，同时有着较长的用药历史。目前药材市场上供应的栀子根多混有部分茎、枝部位，时而出现混有较高比例茎、枝的药材，且该现象较为普遍。本研究拟对栀子根、茎、枝不同部位的抗肝炎药效物质基础、药理活性指标成分齐墩果酸开展研究，为规范栀子根的药用部位，是否拓宽栀子根药用部位，确保栀子根药材质量提供一定的客观依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-20AT高效液相色谱分析仪(日本岛津公司)； Platisil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)； BSA224S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药对照品：齐墩果酸购自上海甄准生物科技有限公司(批号 ZZS18031601，质量分数≥98%)。试剂：甲醇(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)、乙腈(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；水为超纯水。药材：栀子根样品采集自福建厦门、泉州、漳州、宁德等地海拔约60～500 m的野生栀子，经福建中医药大学中药鉴定教研室杨成梓教授鉴定为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥根，此外，还收集了栀子茎、栀子枝等栀子不同部位样品，除去杂质，洗净，切片后干燥，粉碎后过三号筛。以上样品均保存于福建中医药大学药学院生药科研实验室。栀子根、茎、枝样品信息详见表1。

表1 栀子根、茎、枝样品信息表

2 实验方法与结果

2.1 以齐墩果酸为参照指标的薄层色谱鉴别精密称取过三号筛的各种样品粉末1 g，放置带塞锥形瓶中，准确加入4%的盐酸甲醇溶液50 ml，称定重量，加热回流4 h，放置冷却，滤过后，续取滤液25 ml，加水20 ml，蒸干甲醇至约20 ml，用三氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并上述三氯甲烷液，挥干溶液，残渣再加适量甲醇溶解，转移至5 ml容量瓶中，加适量甲醇至刻度，摇匀后，即为供试品的溶液。另外，取齐墩果酸对照品，加入甲醇制备成每毫升中含0.5 mg的溶液，作为对照品备用。参照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502项下薄层色谱法，精密吸取上述两种溶液各10 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯(8∶1∶5)为展开剂，经展开后取出，晾干，再喷10%的硫酸乙醇溶液，薄层板在105 ℃温度加热至斑点清晰显色。作为供试品的薄层色谱中，在相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果详见图1～图3。

图1 栀子根齐墩果酸薄层色谱鉴别图

图2 栀子茎齐墩果酸薄层色谱鉴别图

图3 栀子枝齐墩果酸薄层色谱鉴别图

2.2 以齐墩果酸为参照指标的高效液相色谱定量评价

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品适量置5 ml量瓶中，加甲醇定容配置成对照品储备液，再精密移取一定量对照品储备液于量瓶中，加甲醇定容制成含齐墩果酸1428.00 μg/ml对照品溶液。对照品溶液置于4 ℃冰箱保存备用，临用前经0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

2.2.2 供试品溶液的制备齐墩果酸供试品溶液的制备：取栀子根样品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，放置带塞锥形瓶中，准确加入4%的盐酸甲醇溶液50 ml，称定重量，加热回流4 h，放冷，再称定重量，用4%的盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，续取滤液25 ml，加水20 ml，蒸干甲醇至约20 ml，用三氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，溶液挥干，残渣加适量甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤即得。

2.2.3 色谱条件色谱柱：Platisil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.4%乙酸(B)，比例为97%A-3%B；流速为1 ml/min，等度洗脱15 min；柱温30 ℃；进样量为10 μl；检测波长210 nm。该色谱条件下，齐墩果酸与其他相邻峰的分离度大于1.5，理论板数不低于4000，对照品及样品的色谱图见图4。

注：1.齐墩果酸图4 齐墩果酸对照品(a)与栀子根样品(b)HPLC图

2.2.4 指标成分方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，用甲醇依次稀释配制成11.16、22.31、44.63、89.25、178.50、357.00、714.00、1428.00 μg/ml的8个系列质量浓度的对照品溶液，按“2.2.3”项下相应色谱条件进样测定。以对照品浓度(X，μg/ml)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，进行回归分析，得回归方程Y=2110.6X-3358.7，r=0.9999。结果表明，在11.16～1428.00 μg/ml浓度范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

2.2.4.2 精密度试验准确吸取齐墩果酸对照品溶液，按上文“2.2.3”项下相应的色谱条件测定，连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD值。结果齐墩果酸的RSD为0.17%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.3 重复性试验精密称取栀子根药材粉末约1 g，按上文方法平行制备6份供试品溶液，并按上述色谱条件测定，测定各种成分含量，计算含量的RSD值。结果齐墩果酸的RSD为2.17%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.4 稳定性试验取同一供试品溶液，在0、2、4、8、16、24 h分别按上文中色谱条件进样，记录各种成分的峰面积，计算峰面积的RSD，结果齐墩果酸的RSD为0.45%，表明供试品溶液中齐墩果酸成分在 24 h 内稳定性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验精密称取已知含量的药材粉末0.5 g，平行制备6份溶液，分别加入一定量的对照品溶液，按上文方法制备供试品溶液，按上文色谱条件测定，计算回收率及RSD。结果见表2。

表2 栀子根中齐墩果酸的加样回收率试验结果

2.2.5 含量测定精密称取栀子根样品、栀子茎样品、栀子枝样品粉末(样品采自漳州龙海港尾)约1 g，按上文方法制备供试品溶液，按上文色谱条件进行测定，每个样品平行3份，计算样品中齐墩果酸的含量。结果见表3。

表3 栀子不同部位的含量测定结果

3 讨论

栀子根在急性及传染性肝炎的治疗方面疗效显著，其作为福建地方常用传统中药，我院肝病中心于上世纪五六十年代即开始广泛应用栀子根，历史悠久。据不完全统计，2007—2014年我院门诊药房调剂使用栀子根每年800～1500 kg(不包含医院制剂、中药免煎颗粒)。肝病中心特色医院制剂茵栀颗粒、复方栀子根颗粒、康氏抗纤方、康氏系列方等在广大患者中享有较高的信誉，其处方均以栀子根为君药配伍应用[3]。临床用于治疗慢性丙型肝炎的中成药制剂松栀丸，其组方以栀子根为君药配伍组成。栀子根用药部位为栀子植株根部，不利于生态环境保护和可持续发展，且对药材来源范围局限性显著；目前药材市场上供应的栀子根常混有茎、枝等部位，时而出现混有较高比例茎枝的药材。本实验对栀子根、茎、枝等部位进行较为系统、全面的研究，以期为临床提供品质良好、质量稳定的栀子根药材提供实验依据。

《福建省中药饮片炮制规范》(2012年版)[4]栀子根鉴别项下，其薄层色谱鉴别法采用的对照品为栀子根对照药材，在本实验研究过程中无法采购到其对照药材，故本实验研究未选用栀子根对照药材作为对照品。目前，《浙江省中药炮制规范 》(2015年版)[5]、《湖南省中药饮片炮制规范 》(2010年版)[6]等多省份《炮制规范》和药材标准、或饮片标准中采用了齐墩果酸作为栀子根薄层色谱鉴别的参照指标，故本实验研究采用齐墩果酸作为薄层色谱鉴别的参照指标。目前各省标准以齐墩果酸作为薄层色谱鉴别指标的方法步骤中，栀子根样品需水解回流提取，操作复杂耗时长，且萃取过程中需要用到大量三氯甲烷，毒性较大，该方法尚需进一步优化。本研究显示在以齐墩果酸为参照指标的薄层色谱中，在与对照品色谱相应位置上，栀子根、茎、枝均显示相同颜色的斑点，表明栀子根、茎、枝均含有齐墩果酸成分。

HPLC法测定栀子根中齐墩果酸含量，样品处理方法简单、易于操作，重现性及稳定性良好，故可将齐墩果酸作为栀子根质量评价的依据。栀子根的主要药效物质基础研究目前还处于起步阶段，目前研究文献多以齐墩果酸醋酸酯对其质量进行控制，且由于齐墩果酸醋酸酯对照品的局限性，现有标准以及实验研究中多通过将其水解为齐墩果酸，以齐墩果酸总含量对山里黄根质量进行评价。《湖南省中药材标准 2009年版》[7]中以齐墩果酸为指标，通过薄层色谱法对山里黄根进行鉴别，并增加HPLC高效液相色谱法对其质量进行评价；伍城颖等[8]在《湖南省中药材标准》HPLC法基础上，对齐墩果酸醋酸酯提取水解方法进行改进，建立了更为简单、易于操作的提取方法。本实验方法中，选用齐墩果酸含量作为对栀子根质量评价依据，齐墩果酸对照品在210 nm 处有强吸收峰。色谱条件经遴选设定流动相为甲醇(A)-0.4%乙酸(B)，比例为97%A-3%B，等度洗脱15 min。流速为1 ml/min；柱温30 ℃；进样量为10 μl；检测波长210 nm。该色谱条件下，齐墩果酸与其他相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数均不低于4000。课题组选择齐墩果酸用于栀子根的质量评价的主要指标成分。

本研究在进行栀子根、茎、枝等不同部位中药指纹图谱质量控制模式实验中，选用的对照品为齐墩果酸、山栀苷、去乙酰车叶草酸甲酯、鸡矢藤次苷甲酯、绿原酸、隐绿原酸、羟异栀子苷，分析实验结果提示，栀子的茎、枝与根样品相似度在0.9以上，叶、果实、花与根的化学成分数量及含量相差较大，相似度均低于0.9，与栀子味苦，性寒，功效泻火除烦、清热利湿、凉血解毒；栀子根味甘、苦，性寒，功效清热利湿、凉血止血，两者主要功效有较明显的差别相一致。肖日传等[9]基于多波长HPLC-DAD比较栀子不同部位化学成分差异，结果也表明，栀子不同部位各成分含量差异较大，栀子根、茎与果实、叶差异明显。

本实验研究中齐墩果酸作为评价栀子根质量的指标性成分，为栀子不同部位的质量评价控制和栀子药材资源的综合开发利用提供实验依据。实验研究表明，栀子根、茎、枝3个部位中齐墩果酸均具有显著差异，齐墩果酸含量顺序为根>茎>枝，栀子根齐墩果酸含量较栀子茎相对接近。肖日传等[9]研究提示，竹节参皂苷Ⅳa为栀子根中的主要化学成分之一，表现有一定的抗炎、镇痛、抗肿瘤作用，同时可抗心律失常，对Ⅱ型糖尿病合并脑缺血/再灌注有保护作用等。在对栀子根指标成分齐墩果酸研究的基础上，下一步须对栀子根的其他指标组分竹节参皂苷Ⅳa等进行研究，同时对栀子根、茎、枝不同部位进行药效学实验研究和临床应用情况的调研及临床使用病例的收集、整理、分析。中药多为多组分协同作用发挥功效，栀子茎能否作为栀子根的来源，能否替代栀子根，扩大栀子根用药部位，保护生态环境和资源可持续发展，尚有待下一步药效学等多方面的探索和研究。