植物Hsp90s与耐热性关系的研究进展

汤佳乐 徐海 苑平 何科佳 王仁才 卜范文

（1. 湖南省农业科学院园艺研究所，长沙 410125；2. 湖南农业大学，长沙 410128；3. 国家农业农村部华中地区果树科学观测站，

长沙 410125）

由于全球变暖及不可避免的气候变化，预计在不久的将来会使全球平均气温增加3-5℃［1］。随着预测的气温上升，热应激成为了培育气候适应性作物的重要性状。由于日气温和季节性气温的频繁起伏而引起的长时间热浪事件对世界范围内的农业生产带来了严重的挑战，影响到植物的生长和产量，估计每年损失高达数十亿美元［2］。因此，鉴于人口不断增加，耕地和自然资源不断减少，提高作物的耐热性已成为一个紧迫的问题，而不仅仅是一个研究主题。

热激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）是一种具有高度保守的蛋白质家族，它广泛分布于从原核生物到真核生物的各种生物体中［3］。在高温胁迫条件下，热激蛋白会在短时间大量表达积累，参与植物热应激应答反应，在维持植物细胞的稳定中发挥着重要的作用。据报道，热激蛋白具有伴侣活性［4］。这些热激蛋白也被称为分子伴侣蛋白，在其他几种辅伴侣蛋白的帮助下，它们与部分折叠或变性的蛋白质结合，阻止其自我聚集或促进它们以ATP依赖和独立的方式正确折叠。这些热激蛋白大致分为两大类，即低分子量和大分子量的热激蛋白，根据相应蛋白质的大小分为5大类：Hsp100/Clp、Hsp90、Hsp70、Hsp60/chaperonin和sHsps［5］。在正常情况下，它们具有许多细胞功能，如（1）新合成的蛋白质折叠或协助折叠（Hsp70和Hsp60）；（2）引导蛋白跨细胞膜和细胞间室之间的转运（Hsp70）；（3）阻止寡聚蛋白的聚集、分离和展开（Hsp70、Hsp100、Hsp90和sHsps）；（4）促进不稳定蛋白的降解（Hsp70和Hsp100）；（5）信号分子的形成、信号转导和转录因子的转录激活（Hsp70和Hsp90）［6］。

研究已证明，Hsp90s在控制细胞周期、细胞生存、激素和其他信号通路等多个细胞过程中起着至关重要的作用。Hsp90s在细胞蛋白中是组成性表达，但在非生物胁迫下（主要是高温胁迫），其表达进一步增加了几倍［7-8］。在细胞对胁迫的反应中扮演重要的角色，是维持细胞内环境稳定的关键因素。因此，在热胁迫条件下开展植物Hsp90s的鉴定与分析和功能研究，对正确认识热应激反应的信号转导，热胁迫基因的表达调控和提高植物的耐热性具有重要的意义。本文从Hsp90s的结构、Hsp90s与植物耐热性两个方面综述近几年Hsp90s分子机理的研究进展，旨为推动植物热激蛋白的研究奠定一定的基础。

1 Hsp90s的结构

Hsp90s是分子量大小约为90 kD的热激蛋白家族，它具有高度的保守性和稳定性及分布广泛的特点［9］。从不同植物中分离鉴定出的细胞器特异性Hsp90，酵母和动物的氨基酸同源性为63%-71%。在拟南芥中，4个AtHsp90位于细胞质上（AtHsp90-1到AtHsp90-4），而AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7分别位于质体、线粒体和内质网上。

Hsp90s主要是以同型二聚体存在，具有3个结构域：高度保守的N端结构域（NTD，～25 kD）、中间结构域（MD，～40 kD）、C端结构域（CTD，～12

kD）［10］。N端结构域包含ATP结合位点，具有内源的ATP酶活性，该位点是Hsp90内源性ATP酶活性弱的原因。中间结构域是底物蛋白结合的主要位点，通过一段高电荷连接区连接到N-末端结构域。C端结构域是二聚化的结合位点，也是钙调蛋白和其他底物蛋白结合位点。在真核生物细胞中，Hsp90s的C端有一个保守的MEEVD结构基序，该基序负责与含共伴侣的四肽重复结构域（Tetratricopeptide repeat domain，TPR）相互作用。在真核生物中，细胞质Hsp90存在两种亚型，即诱导型α型和组成型β型，并且至少一种亚型在功能上对生物体生存至关重要［11］。由于其在不同的物种中相对分子质量的差异，这些Hsp90s同源基因有着不同的名称（如Hsp80、Hsp81、Hsp82、Hsp83、Hsp84和Hsp90等）。通 过分析Hsp90s基因的氨基酸序列可以揭示其亚细胞定位。这可能是由于在N端或C端区域存在可区分的氨基酸特殊基序，即细胞溶质特异性Hsp90亚型的C端MEEVD基序和内质网特异性Hsp90亚型的C端HDEL基序，而叶绿体和线粒体特异性Hsp90亚型的N端信号肽序列特殊性延伸［12］。

2 Hsp90s与植物耐热性

植物在高温胁迫条件下，蛋白质的折叠过程受到很大的影响，从而导致错误折叠蛋白的繁殖和蛋白质功能障碍。为了缓解蛋白质的错误折叠反应，自然界开发了高效的植物分子伴侣机制，通过增加已有的分子伴侣水平和通过信号机制表达额外的伴侣来维持细胞内的高质量蛋白质［13］。植物在热激逆境条件下能够诱导Hsps基因的表达，其中许多Hsps基因作为分子伴侣防止蛋白质变性和维持体内蛋白平衡，如果没有这些分子伴侣的帮助，活细胞中的许多蛋白质不能正常折叠［14］。然而，Hsp90s是一类在热应激条件下对维持细胞功能起重要作用的分子伴侣［15］。它们在植物的营养和生殖生长过程中起着重要的作用，调节着植物对各种生物和非生物胁迫的反应。在热胁迫条件下，Hsp90s在行使分子伴侣的功能、表达调节模式、生长发育过程及参与耐热性方面发挥重要作用。

2.1 Hsp90s分子伴侣功能

当植物体处在有害或极端的环境条件下，它们的细胞会激活并大量产生一类热激蛋白，这类热激蛋白也称为分子伴侣蛋白。它们是蛋白质稳定网络的重要组成部分，保护和保捍卫细胞蛋白质免受伤害。研究表明，Hsp90s是具有分子伴侣功能的一类蛋白质家族［16］。Hsp90s作为分子伴侣与其他辅助蛋白协同工作，共同构成了伴侣蛋白复合物的重要组成部分。它们和辅助蛋白与错误折叠的蛋白相结合，防止分子蛋白的聚集和后续的再折叠、协助新合成蛋白的正确折叠、维持蛋白质功能稳定及促进异常蛋白的降解，在规避恶劣的生长环境条件下发挥着重要的作用。Song等［17］通过分析5个AtHsp90基因在酵母菌中的表达发现，细胞溶质AtHsp90-1和AtHsp90-2具有与酵母相似的伴侣功能，在适宜和不适宜温度下都能支持酵母突变体的生长。在热胁迫条件下，细胞溶质AtHsp90s能稳定温度敏感的Hsp90突变株的生物膜。该研究结果揭示了细胞溶质AtHsp90s作为分子伴侣具有在热应激条件下稳定植物细胞稳定的功能。Kravats等［18］研究发现酵母中纯化的Hsp90突变体蛋白在与Hsp70和辅伴侣蛋白（Hop）的协同作用下，在蛋白重塑方面存在缺陷。该研究证实，Hsp90与Hsp70和其他蛋白协同作用，在蛋白质折叠中起关键性作用，使蛋白质受体能自行折叠。Cha等［19］研究发现Hsp90与辅伴侣分子Dgp23与相互作用，通过抑制苹果酸脱氢酶的热聚集，在植物的耐热性方面起重要作用。此外，Hsp90还能与其他蛋白协同作用，如Hip（Hsp70相互作用蛋白）和Hsp40等，它们在其他细胞重塑反应中相互协作，在热胁迫条件下蛋白的修复和细胞的存活均发挥积极的作用［20］。

2.2 热胁迫条件下Hsp90s表达调节模式

高温胁迫扰乱细胞的稳定性，造成细胞正常代谢受阻，导致植物生长迟缓或者细胞死亡，严重影响植物的生长发育，如果发生在开花期间，则更容易受到伤害。高等植物无法适应长期遭受超过45℃的高温［21］。在高温胁迫条件下，植物细胞中蛋白质失去生物活性可能归因于蛋白质聚集或蛋白质错误折叠或两者都有［22］。应激诱导的聚集和错误折叠蛋白的积累过程是不可逆的，而且对细胞功能造成伤害。为了平衡热胁迫下细胞中蛋白质稳定，植物细胞上调了几个热诱导基因，通常称为“热激基因”（Heat shock genes，HSGs），这些热激基因的表达和积累，使植物在高温下存活［23-24］。

植物在受到高温胁迫时，细胞内的蛋白质不能维持正常的折叠结构，产生大量的解折叠结构的蛋白质。植物为了减轻解折叠结构蛋白质的反应，Hsp90s等热激蛋白信号通路在细胞环境中被激活。在正常情况下，Hsp70（或Hsp90及多伴侣复合体）与热激转录因子（Heat shock factor，Hsf）相互作用而使Hsf处于钝化的单体状态。Hsf是植物体内细胞调节热激反应的一类主要转录因子。在热激反应时，植物细胞内热激蛋白（Hsps）与解折叠的蛋白相结合，使Hsf形成三聚体并转移到细胞核，并与热激元件（Heat-shock element，HSE）结合启动Hsps基因的转录，产生并积累Hsps。在热激反应减弱时，高浓度的Hsps能降低Hsf与细胞DNA结合的活性，促进Hsf三聚体的解聚，于是Hsps又与Hsf相结合，使其恢复为钝化的单体状态，关闭Hsf的活性，抑制Hsps的过度合成（图1）［25］。张海［26］对水稻中的9个Hsp90基因进行了表达量分析，OsHsp90-2和OsHsp90-4在热激胁迫的表达上调，并将它们转化大肠杆菌发现均能够提高转化菌株的细胞活性和增强高温逆境条件下的耐受力。因此，Hsp90s参与了植物的热胁迫条件下的表达的调节，并通过产生和积累Hsps增强了植物的耐热性，从何使植物细胞维持正常的生理行为。

2.3 Hsp90s与植物的生长发育

图1 热激条件下Hsp90s表达调节模式图

目前，Hsp90s在植物生长发育方面的作用早已被公认。在正常情况下，Hsp90s在细胞内含量丰富，约占细胞总蛋白的 1%-2%，在细胞中呈高组成性表达［27］。在没有胁迫的条件下，甘蓝型油菜种子在发育和萌发过程中，Hsp90具有很高的表达量，表明了Hsp90在种子发育和萌发过程中起到了重要的作用［28］。Sable等［29］对5个陆地棉基因型的微阵列数据分析显示，在纤维发育的不同阶段，GhHsp90基因的转录水平较高，进一步的研究表明Hsp90在棉纤维的分化和发育中起着至关重要的作用。Wang等［30］对小麦中细胞质Hsp90基因进行了系统测定，并通过病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）降低TaHsp90.1基因的表达发现，对小麦幼苗生长有明显的抑制作用，该研究证实了细胞质Hsp90基因参与了幼苗的生长发育。此外，在热激和其他应激条件，Hsp90s可以进一步诱导其表达。在正常条件下，经抗生素处理的拟南芥种子在12日龄幼苗的时候可以激活Hsp90的合成［31］。AtHsp90-1是拟南芥中唯一可以被诱导的Hsp90成员，该基因在生长活跃期组成性表达水平较低，但在成熟的种子的胚胎中强烈地表达［32］。与组成型Hsp90突变体相比，AtHsp90-1系中不能存活种子和有缺陷胚的比例更大，且部分幼苗早死或生长发育迟缓［33］。这表明，可诱导的AtHsp90-1是植物稳定生长和形态正常所必需的，尤其在胚的形成和种子成熟的时期。同样，敲除AtHsp90-3的突变体导致拟南芥开花推迟［34］，敲除AtHsp90-5的突变体导致拟南芥的胚发育受损和种子活力丧失［35］，AtHsp90-7的缺失导致拟南芥的茎、花和根分生组织紊乱，花器官增多，花粉管加厚伸长［36］。研究发现，Hsp90还具有调控气孔发育的功能。拟南芥Hsp90的相关突变体，通过热激处理可以抑制气孔的发育，并且Hsp90可以通过MAPK信号通路调节正常和高温条件下气孔的起始和形成，调控气孔的发育［37］。

Hsp90s也被认为是形态学进化的标志［38］。这表明，Hsp90s具有管家蛋白的功能［39］。Neuwald等［40］研究发现Hsp90在热胁迫下参与了植物的不同功能，如生物量的增加、结荚、减少脂质过氧化和叶绿素的损失。Sangster等［41］对模式植物拟南芥Hsp90的抑制发现拟南芥表型结构发生了改变，Hsp90的降低影响了开花时间和总结实率等生长发育过程中的多种数量性状，增加了形态多样性，降低了重复性状的发育稳定性。总之，我们认为在许多不同刺激的环境条件下，Hsp90对植物生长发育反应性具有全面性的影响。

2.4 Hsp90s参与植物耐热性

不断升高的温度对地球生态环境产生了深远的影响，任何温度的升高都会对植物的生长和产量产生负面影响。在过去的10年里，组学研究显示，在高温胁迫条件下热激蛋白受到了不同的调节。Song等［42］在ABA、PEG、NaCl、低温和高温胁迫条件下，对烟草Hsp90s的表达模式进行了分析发现，高温胁迫对烟草Hsp90s的诱导作用最强。Agarwal等［43］通过对比耐热和热敏基因型鹰嘴豆的根、叶、花器官中的Hsp90基因表达量，发现耐热型鹰嘴豆的各个组织中Hsp90基因的表达量比热敏型鹰嘴豆均有上调，并且在热敏基因型鹰嘴豆中也能诱导Hsp90基因表达。这表明Hsp90s基因参与热胁迫的响应过程。同样，许多模式植物和农作物（拟南芥、烟草、水稻、大豆、葡萄、番茄和香蕉等）中，Hsp90s基因在热胁迫条件的响应已被鉴定，并已被证实参与调节耐热性［44-45］。

此外，研究表明，Hsp90s的成员常被发现热胁迫反应中上调［46］。在高温胁迫条件下，OsHsp90.1和AtHsp90的诱导量最大［47-48］。在大肠杆菌中，水稻OsHsp90-2过表达能够提高细胞活力，显著提高植株的在热胁迫条件下的耐热性［49］。同样，12个大豆的GmHsp90基因在高温胁迫下均能被强烈诱导，其中5个GmHsp9基因的过表达增加了拟南芥对热胁迫的耐受性［39］。Huang等［50］利用转基因大豆中GmHsp90A2过表达的稳定系和CRISPR/Cas9系统产生的突变系研究发现，过表达GmHsp90A2的T3转基因大豆植株通过提高叶绿素含量和降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，表现出更高的耐热性。相反，T2纯合敲除GmHsp90A2突变体叶绿素含量降低，MDA含量增加，耐热性下降，进一步证明GmHsp90A2是正向调节植株的耐热性。同样，在拟南芥中敲除AtHsp90-1突变体使植株的耐热性降低［51］。但是，也有证据表明，Hsp90的过表达可以降低植物细胞的耐热性。在拟南芥中，AtHsp90.3的过表达降低了植物对热胁迫的耐受性，表明Hsp90的稳态性在植物的细胞应激反应和热胁迫耐受性方面至关重要［52］。这可能是Hsp90的过量表达诱导Hsf的下调，导致细胞的耐热性降低的原因［53］；也可能是植物耐热机理是受多个基因的协调调控，不是受到单个Hsp90基因的影响。Hsp90s基因与其他热激蛋白基因家族协同作用，使植物细胞适应高温胁迫的作用，维持细胞内环境稳定。

3 展望

高温胁迫是影响植物生长发育，降低作物产量的主要非生物胁迫之一。因此，提高作物的耐热性等抗逆性已成为一个紧迫的问题。Hsp90s是参与植物热应激条件下应答响应的一类重要的基因家族。目前，随着测序技术的不断发展和广泛使用，在理解植物耐热性这一复杂性状方面取得的一个重要进展是越来越多的植物基因组序列信息的完成。但是对于不同植物基因组中的Hsp90s基因家族的鉴定、基因结构、系统发育关系、染色体定位等尚需要进一步深入研究和分析。因此，利用功能基因组学的方法，对植物Hsp90s基因家族进行分析，并对其功能进行精确的描述将成为新的重要研究方向。此外，大量可用的基因组数据的也使我们能够识别参与热胁迫应答潜在的顺式调控元件和反式因子。同时，利用转录组数据分析植物Hsp90s基因在热激条件下表达的差异，为进一步阐明植物Hsp90s的诱导产生与积累的分子机制奠定了重要的研究基础，并为Hsp90s基因功能分析和植物耐热抗性品种的栽培选育提供广阔的应用前景。