2013-2019年重庆市脊髓灰质炎实验室细胞系质量控制情况分析 *

彭靖尧，黄 为，谢武娟，凌 华，张 敏，赵 华

重庆市疾病预防控制中心,重庆 400042

脊髓灰质炎(简称脊灰)是由脊髓灰质炎病毒(PV)急性传染引起，在儿童中发生，以肌肉麻痹为主要症状。PV在全球曾广泛传播。1988年世界根除脊灰行动开始后，随着灭活疫苗(IPV)、减毒活疫苗(OPV)在全球范围内的广泛使用，迄今为止，全球范围内脊灰病例已经减少了99%，世界上绝大多数地区已经消除了脊灰[1]。从2000年开始，中国进入“无脊灰”状态，即没有脊灰野病毒引起的脊灰病例[2]。但截至目前，我国仍然在广泛使用OPV，OPV可能导致疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)的出现，这是在即将消灭脊灰的现阶段工作中所面临的重要问题[3]。在现阶段，检测PV的金标准仍然是细胞分离，我国脊灰网络实验室使用人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)系和转人脊灰受体的小鼠肺细胞(L20B细胞)系这两种细胞系对PV进行细胞分离。因此，保证RD和L20B细胞系对PV的高度敏感性，对所用细胞系进行有效的质量控制，才能及时分离出标本中低水平的PV，以确保不漏检脊灰野病毒及VDPV[4]。本研究对重庆市疾病预防控制中心脊灰实验室2013-2019年PV分离所用细胞系的质量控制情况进行分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 本研究使用的RD细胞系和L20B细胞系均来自中国疾病预防控制中心脊灰实验室，将所获得的RD细胞系和L20B细胞系进行传代，建立细胞库冻存于液氮罐中，定期复苏细胞传代备用。

1.1.2标准毒株 本研究中使用的毒株有细胞敏感性实验参考株(CSTR)和重庆市实验室质控株(LQC)。其中CSTR来自中国疾病预防控制中心脊灰实验室，LQC由重庆市脊灰实验室按照世界卫生组织(WHO)推荐的标准操作规程进行制备[5]。经历3次独立实验后确定平均滴度值(期望值)，LQC确定滴度后分装于冻存管(每管0.1 mL)，超低温冰箱-80 ℃保存，同时将LQC滴度上报WHO，经反馈认可后用于日常细胞敏感性实验。

1.2方法

1.2.1支原体检测 采用聚合酶链反应(PCR)法检测L20B和RD细胞系有无支原体污染。PCR试剂使用宝生生物(Takara Bio)的Prime Script One Step RT-PCR Kit Ver.2，使用引物如下，F1：5′-ACA CCA TGG GAG CTG GTA AT-3′；R1：5′-CTT CAT CGA CTT TCA GAC CCA AGG CAT-3′。引物来自中国疾病预防控制中心脊灰实验室。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，32个循环；72 ℃ 10 min。阳性扩增产物大小约为450 bp。

1.2.2细胞敏感性实验 分别用已知型别和滴度的LQC进行检测，具体实验步骤参照WHO推荐方法，要求每次细胞敏感性实验中检测的病毒滴度值在WHO认可的LQC滴度值±0.5以内。病毒滴度采用Karber公式计算。Karber公式：logCCID50=L-d×(S-0.5)，L为最低稀释度log值，d为稀释梯度log值，S为各个稀释度中细胞病变孔数所占比例的总和。细胞敏感性实验中，96孔板每孔通常加入0.1 mL的病毒悬液用于检测，故细胞敏感性实验结果常用logCCID50/0.1 mL表示，释义为每0.1 mL病毒稀释液对应的半数细胞病变数的对数值。

1.3统计学处理 数据录入、整理和图表制作使用Excel2010软件。

2 结 果

2.1重庆市脊灰实验室LQC滴度 2013年1月至2019年3月重庆市脊灰实验室细胞敏感性实验中使用的3个型别的LQC(SabinⅠ、SabinⅡ、SabinⅢ)为本实验室2007年制备，标记为LQC2007。2019年4月细胞敏感性实验使用新制备的LQC，标记为LCQ2019(2016起SabinⅡ型细胞敏感性实验停止，因此未制备LCQ2019SabinⅡ)。LQC2007、LCQ2019各型别在RD细胞系和L20B细胞系上经WHO认可的平均滴度值见表1。

2.2支原体检测实验 重庆市脊灰实验室于2015年起按中国疾病预防控制中心要求，在每次细胞敏感性实验前均对L20B和RD细胞系进行支原体检测。2015年1月至2019年12月，累计进行19次支原体检测实验，结果均为阴性。

表1 重庆市脊灰实验室各型别LQC期望滴度值及可接受波动范围(logCCID50/0.1 mL)

2.3细胞敏感性实验 2013-2019年重庆市脊灰实验室按照WHO推荐标准实验方法进行了27次细胞敏感性实验，自2016年起，在全球范围内三价OPV(含SabinⅠ、SabinⅡ、SabinⅢ)被二价OPV(SabinⅠ、SabinⅢ)代替，WHO宣布消灭二型PV，SabinⅡ标准株的细胞敏感性实验停止。2013年1月至2019年3月，使用LQC2007进行细胞敏感性实验，在L20B细胞系上，敏感性实验滴度分别如下：SabinⅠ为(8.28±0.43)logCCID50/0.1 mL，SabinⅡ为(7.87±0.27)logCCID50/0.1 mL，SabinⅢ为(7.77±0.47)logCCID50/0.1 mL。RD细胞系上，敏感性实验滴度SabinⅠ、SabinⅡ、SabinⅢ分别为(8.15±0.48)、(7.95±0.50)、(8.23±0.43)logCCID50/0.1 mL。2019年3月后，使用LQC2019进行实验，在L20B细胞系上，敏感性实验滴度SabinⅠ、SabinⅢ分别为(7.70±0.04)、(7.10±0.30)logCCID50/0.1 mL，RD细胞系上，敏感性实验滴度SabinⅠ、SabinⅢ分别为(8.06±0.39)、(7.83±0.13)logCCID50/0.1 mL。L20B细胞系上各型别的LQC2007滴度波动情况见图1，RD细胞系上各型别的LQC2007滴度波动情况见图2。由于仅使用LQC2019进行了3次细胞敏感性实验，故对其结果未进行作图分析。

图1 多次实验各型别LQC2007在L20B细胞系上的滴度波动情况

图2 多次实验各型别LQC2007在RD细胞系上的滴度波动情况

3 讨 论

病毒的细胞分离培养是实验室检测的“金标准”，经细胞分离培养得到的高水平和高纯度的病毒毒株，可以为后续一系列的病毒鉴定和深入研究打下基础。相关研究指出，使用L20B细胞系和RD细胞系进行PV分离有较高的灵敏度，其灵敏度不亚于分子生物学方法[6]。WHO从2015年开始，在全球PV检测实验室推行了最新版的PV分离流程[7]，这样又进一步提高了PV的分离效率。因此，对PV的细胞分离工作实施质量控制，有着重要意义。

PV分离工作质量控制的核心是保证分离病毒所用细胞系的质量，这是PV监测工作准确性的前提，也是PV诊断工作的基础。影响细胞系生长的因素众多，包括培养细胞所需的原材料质量(胎牛血清、培养液、缓冲液等)、细胞生长条件(培养温度、二氧化碳浓度)、培养液污染(细菌、支原体等)。WHO推荐脊灰实验室中细胞系质量控制的有效方法是支原体检测和细胞敏感性实验[8]。支原体广泛分布于自然界，其最佳生长温度是37 ℃[9]。实验室细胞系极易被支原体污染，被支原体污染的细胞通常不会有细胞病变，或仅引起细微的变化不易被察觉，使用PCR法可以快速、准确地检测细胞系中的支原体，以确定细胞系是否被支原体污染。PV细胞敏感性实验结果可直接反映出细胞系对特定型别PV的敏感程度，以此确定细胞系生长状态是否正常，从而达到对细胞系的质量控制。

2013-2019年重庆市脊灰实验室累计对细胞培养液进行了19次支原体检测(2015年开始，按照中国疾病预防控制中心脊灰实验室要求进行支原体检测)，检测结果均为阴性，表明这期间细胞系没有被支原体污染。支原体感染细胞培养液后，会黏附于细胞表面，进而影响细胞运输机制和细胞膜受体。有研究指出，L20B细胞系被支原体污染后，其细胞膜上的PV受体CD155会被支原体干扰，从而降低对PV的敏感性[4]。当支原体检测为阳性时，必须追溯整个细胞培养的全过程，如更换细胞系来源、对实验器具消毒处理、重新配置实验试剂等，重新检测支原体阴性后才可以进行细胞敏感性实验。

从重庆市脊灰实验室2013-2019年的细胞敏感性实验结果来看，27次细胞敏感性实验中，L20B细胞系和RD细胞系上各型别LQC的检测滴度均在期望值±0.5logCCID50/0.1 mL内，表明这期间重庆市脊灰实验室所用细胞系对PV有着较高的敏感性，24次LQC2007的细胞敏感性实验表现出在RD细胞系上各型别LQC的滴度均高于L20B细胞系上的滴度，此结果与黑龙江省的相关研究一致[10]。通过细胞敏感性滴度曲线图可以看出，截至2019年3月21日(第24次实验)，L20B细胞系上的SabinⅠ型LQC滴度均在期望值以下，并且随时间延长呈现下降趋势；SabinⅢ型LQC在RD细胞系和L20B细胞系上均表现出滴度下降趋势。理想的细胞敏感性实验结果应该是在期望值上下波动，笔者认为上述现象可能由以下因素导致：(1)2007年制备的LQC在确定其期望滴度值时，所用细胞系传代代数较低，其后进行细胞敏感性实验所用细胞系已经过多次传代，细胞系随传代代数增加，对LQC的敏感性可能出现衰退[8]。(2)LQC经过长时间的冻存，其病毒活性可能下降。针对这个问题，重庆市脊灰实验室于2019年4月重新制备了LQC，使用新的LQC进行的3次细胞敏感性实验结果均正常，新的LQC可用于代替2007年制备的LQC，用于细胞系质量控制。

综上所述，重庆市脊灰实验室所用细胞系对PV保持了较高的敏感性，但仍然存在问题，应加强细胞系的质量控制工作。在消灭脊灰的最后阶段，脊灰实验室细胞系的质量控制必不可少，在实际工作中应结合支原体检测和细胞敏感性实验两种方法对细胞系进行质量控制，及时发现存在的问题，保证PV监测系统的敏感性，确保及时、准确地发现与鉴别PV。