荧光染色法在真菌镜检中的应用 *

李艳君,钱扬会,丁毅伟,丁赔赔,王姣贤,董 蓉,赵强元△

1.解放军总医院第六医学中心检验科，北京 100048;2.南方医科大学第二临床学院，广东广州 510515

近年来，随着肿瘤、艾滋病等免疫功能受损患者的增多，以及免疫抑制剂及广谱抗菌药物的长期使用，真菌感染发病率呈上升趋势。侵袭性真菌感染(IFD)是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-2]。真菌感染的快速诊断对于临床抢先实施抗真菌治疗，降低病死率至关重要。真菌感染的实验室检查中直接涂片染色镜检可快速为临床提供直观的病原学证据。目前，大部分实验室常规采用革兰染色法进行深部真菌感染的染色镜检，但真菌孢子及菌丝不易着色，与背景颜色不易区分，检出率低。近年来，荧光染色法在真菌染色镜检中的应用越来越广泛，尤其是在浅部真菌病诊断中广泛应用[3-4]，而用于深部真菌感染标本的镜检诊断鲜有报道。本文通过与革兰染色法比较，评价荧光染色法用于可疑深部真菌感染标本镜检的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年1月至2019年6月可疑深部真菌感染患者的临床标本共350例，标本类型包括痰液(228/350，65.1%)、肺泡灌洗液(35/350，10.0%)、气管刷片(16/350，4.6%)、尿液(58/350，16.6%)、肺组织(3/350，0.8%)、深部伤口拭子(10/350，2.9%)。

1.2仪器与试剂 法国梅里埃PREVI Color Gram自动染片仪，奥林巴斯CX23荧光显微镜和CX41普通光学显微镜，德国布鲁克公司MALDI-TOF MS鉴定仪，法国梅里埃沙保罗培养基，法国梅里埃革兰染色液，南京汉瑞生物真菌荧光染色液。

1.3方法 标本采集后同时进行真菌培养鉴定、涂片后革兰染色镜检和荧光染色镜检等操作，质控菌株为白色念珠菌ATCC90028。

1.3.1真功培养鉴定 标本以三区划线方式接种沙保罗培养基，置于28 ℃真菌培养箱2～3周。每日观察，待长出菌落后应用MALDI-TOF MS鉴定仪进行菌种鉴定，如鉴定为真菌，记录为培养阳性。

1.3.2革兰染色镜检 标本涂片后应用革兰染片仪进行革兰染色，应用普通光学显微镜进行油镜下阅片。见到染成紫色的真菌孢子、真菌丝和假菌丝等真菌结构记录为阳性。

1.3.3真菌荧光染色镜检 标本涂片后滴加1滴真菌荧光染色剂，盖上盖玻片，擦去多余染色剂，置于荧光显微镜下阅片。见到发出绿色荧光的真菌孢子、真菌丝和假菌丝等真菌结构记录为阳性。

1.4判断标准 因为真菌培养有漏检，故本研究没有将真菌培养作为金标准来评价，而是综合3种方法，只要任意一种检测出真菌，则认为该标本有真菌，并以此为真阳性，3种方法均未检出真菌，则为实测阴性。

1.5统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理和分析。计数资料以率或例数表示，3种方法的真菌检出率以及革兰染色镜检和荧光染色镜检的灵敏度、特异度比较，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13种方法的真菌检出率比较 革兰染色法、荧光染色法和真菌培养鉴定法的总检出率分别为11.4%、53.4%和43.4%。3种方法的真菌检出率比较，差异有统计学意义(χ2=174.056,P<0.05)。见表1。

表1 3种方法的真菌检出率比较[n(%)]

2.23种方法的灵敏度和阴性预测值比较 3种方法中，任意一种方法检出真菌，则认为该标本真菌检测阳性。350例标本中，实测阳性共216例；3种方法均未检出真菌，则为实测阴性，共134例。革兰染色法检出真菌40例，荧光染色法检出真菌187例，真菌培养鉴定法检出真菌152例，3种方法灵敏度和阴性预测值见表2～3。3种方法灵敏度和阴性预测值的差异均有统计学意义(χ2=224.862、74.646，P<0.05)。

2.3革兰染色法与荧光染色法镜下分辨能力比较 革兰染色法和荧光染色法下真菌孢子及菌丝镜下形态见图1。

表2 3种方法的灵敏度比较

表3 3种方法的阴性预测值的比较

注：A为革兰染色菌丝；B为荧光染色菌丝；C为革兰染色孢子；D为荧光染色菌丝。

3 讨 论

实验室检查是真菌感染诊断的金标准，在排除污染的前提下，无论是涂片染色镜检还是真菌培养鉴定，只要检出阳性结果就可以明确诊断。相对于真菌培养鉴定，涂片染色镜检操作简便，可快速得到检测结果，为临床治疗提供依据。

真菌的镜检方法有很多，目前大部分实验室对于深部真菌感染的涂片镜检多采用革兰染色法[5-7]，革兰染色法用于细菌镜检可以较好地区分革兰阳性菌和革兰阴性菌，但对于真菌而言，菌丝和孢子不易与革兰阳性菌、红细胞、白细胞以及上皮细胞区分。如图1A所示，真菌菌丝不易着色或着色不均，图1C中的真菌孢子不易辨别，故革兰染色法查找真菌容易漏检。荧光染色法是近年来应用于真菌镜检的染色方法，可用于各种疑似真菌感染的检查[8-10]，染色液中的荧光增白剂能够特异地结合真菌细胞壁β-多糖成分，如几丁质、葡萄糖、纤维素。在荧光显微镜下，真菌孢子及菌丝发出黄绿色或淡蓝色荧光，与暗背景形成鲜明对比。如图1B所示，真菌菌丝经荧光染色，清晰可辨；图1D所示，经荧光染色的真菌孢子，与背景对比清晰，呈现出明显的立体感。因此，对镜检的镜下分辨能力而言，荧光染色法能够更加清晰地辨识真菌结构，无论在真菌的检出还是菌种的初步鉴定上均具有一定的优势。

鉴于革兰染色法镜下对真菌的观察和鉴别能力有限，本研究进而对3种真菌检测方法的检出率、灵敏度和阴性预测值进行评价。本研究所有标本经革兰染色法、荧光染色法和真菌培养鉴定法检测，任意一种方法阳性则认为该标本真菌检测阳性，以此为标准计算各种方法真菌检测的灵敏度和阴性预测值。首先，从3种方法的检出率来看，350例临床标本中，荧光染色法真菌检出率为53.4%，真菌培养鉴定法为43.4%，革兰染色法为11.4%，3种方法的检出率差异有统计学意义(P<0.05)。其次，从3种方法的灵敏度来看，荧光染色法的灵敏度为86.6%，真菌培养鉴定法为70.4%，而革兰染色法仅为18.5%，两种染色方法灵敏度差异有统计学意义(P<0.05)。本研究中部分临床标本真菌培养阴性，但荧光染色法镜下可见真菌结构，其原因可能是某些种类的真菌对营养要求较高，体外培养不易生长，或者临床应用抗真菌药物后导致真菌活性降低或死亡，导致培养阴性，而荧光染色法镜检可以规避上述问题，提高真菌检测的灵敏度。最后，从3种方法的阴性预测值来看，荧光染色法的阴性预测值为82.2%，真菌培养鉴定法为67.7%，革兰染色法为43.2%，两种染色方法阴性预测值差异亦有统计学意义(P<0.05)。阴性预测值是评价一种检测方法检测真阴性的能力，也就是说阴性预测值越小，其漏检率越高。从本文数据来看，350例标本中，革兰染色法报告310例阴性，而真阴性仅为134例，也就是说该方法漏检176例，漏检率高达56.8%，而荧光染色法则极大降低镜检的漏检率。

综上所述，本研究评价了3种真菌检测方法的检测能力：从镜下观察来看，荧光染色法对比度好，具有更好的分辨能力；从检出率、灵敏度和阴性预测值3个评价指标来看，荧光染色法均优于革兰染色法；从操作方法来看，与真菌培养鉴定法及革兰染色法相比，荧光染色法操作更为快捷、简便。因此，荧光染色法在真菌镜检中具有较高的应用价值，值得临床推广应用。