补骨脂素通过刺激成肌分化促进骨质疏松性骨折愈合的疗效观察

邱丽玲，金镇雄，赵永见，侯彤，吴弢，高翔*，唐德志

1.复旦大学附属华东医院伤外科，上海200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海200032

骨质疏松症是一种常见性疾病，其低骨量和恶化的骨微结构使得骨折发生的可能性增加。流行病学显示，我国60 岁及以上妇女骨质疏松症发生率为53.8%，伴随骨折的发生率为32.6%[1]。骨质疏松症可造成疼痛和伤残。在欧洲，每年因骨质疏松性骨折而花费的医疗费用达230 亿美元[2]，给社会造成了经济负担。

骨折发生后，骨骼和肌肉均会受到损伤，肌肉修复情况会影响骨折愈合质量。Harry 等[3]在骨折实验中发现，当被肌瓣包围时，骨修复速度加快。随着研究深入，研究者们发现肌肉骨骼系统远比单个组织骨骼或肌肉复杂[4]。有证据表明，骨骼和肌肉之间联系并不局限机械偶联，还存在分子水平关联[5]。骨骼和骨骼肌均可分泌因子对其他组织产生影响[6]。因此理解骨和肌肉之间生化联系可能给骨疾病治疗提供新思路。

传统理论中，肾虚是骨骼疾病发生的基础。补骨脂补肾温脾，补骨脂素（psoralen）为其中有效成分。我们前期研究[1]发现，补骨脂素通过调控BMP 信号通路刺激成骨细胞分化。但是补骨脂素对成肌分化作用尚未有报道，因此，探讨补骨脂素对成肌细胞分化的影响，有助于阐明补骨脂素促进骨折愈合的具体机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 上海中医药大学动物房订购2月龄C57BL/6 雄鼠30 只，SPF 级饲养至3月龄。实验过程中自由饮水进食。许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 实验试剂和仪器 Micro-CT（SCANCOMedical 公司,瑞士）；苏木素染色液购自南京建成科技有限公司；Anti-MyoD1 antibody、 Anti- MEF2C antibody、Anti-Myf5 antibody、和Anti-Myogenin antibody 均购自美国abcom 公司；GAPDH Mouse monoclonal antibody (6004-1-lg，美国proteintech 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 建立骨质疏松模型 3月龄小鼠麻醉后，平铺在手术台上。睾丸被推入阴囊后，在阴囊上剪口，结扎并切下睾丸，缝合伤口。

1.3.2 分组：去睾丸后3 个月，随机分组：补骨脂素组、对照组，每组15 只。

1.3.3 骨折模型建立[7]：骨质疏松术后3月，麻醉后仰卧位，剃净鼠毛消毒，针头由胫骨前上处插入下部骨腔，到胫骨下剪断，抵入胫骨平台下部分，缝合。术后连续灌胃28d，隔天1 次。

1.3.4 药物配制（1）将20 mg 补骨脂素溶于20 mL 的玉米油中，震荡混匀。（2）小鼠剂量=1/70×10×体质量×数量×次数。2 组均以每只0.3 mL/d 药物或生理盐水灌胃。

1.3.5 Micro-CT 骨骼样本固定并冲洗后，使用18 m 分辨率逐层扫描成像。

1.3.6 HE 染色 比目鱼肌标本在常规脱水、透明和石蜡包埋后，使用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染液，在光学显微镜下观察骨骼肌愈合情况。

1.3.7 RT-PCR 胫骨后肌中加入Trizol 和钢珠，震荡混匀后室温静置。加入氯仿，离心吸取上层水相，加异丙醇离心；加DEPC 水并检测总RNA 浓度及吸光度值。逆转录反应生成cDNA。行PCR 反应。引物序列见表1。

1.3.8 Western blotting 将胫骨后肌在液氮冷冻条件下碾成粉，加入RIPA buffer 裂解液，离心收集上清，测蛋白浓度。样品煮沸，定量上样后电泳；分离蛋白后转膜，膜置封闭液中1 h 后,敷一抗过夜；洗膜后二抗孵育并显色。采用Image J 软件分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白（灰度）/内参GAPDH（灰度），并将所得数据放入Graphpad prism 绘图。每个实验样本均重复3 次。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0 进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用LSDt 检验，＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨折断端Micro-CT 比较 三维重建图看出，补骨脂素组的小鼠胫骨骨折线基本消失，较多板状骨痂存在，骨髓腔已通。对照组小鼠骨痂仍有不同程度吸收，骨痂较疏松，见图1。

2.2 比目鱼肌HE 染色结果比较HE 染色显示，补骨脂素组的肌纤维排列紧密，肌细胞较多。对照组肌纤维排列较疏松，见图2。

表1 引物序列

2.3 成肌分化相关基因在胫骨后肌中表达情况 提取肌肉组织总RNA，RT-PCR 检测成肌分化相关基因表达水平。结果发现，与对照组比较，MyoD1、MEF2C、Myf5、Myogenin 成肌分化基因在补骨脂素组中表达上升（＜0.05），见图3。

2.4 成肌分化相关蛋白在胫骨后肌中表达情况 为了解成肌分化相关蛋白在胫骨后肌中表达情况，对胫骨后肌中这些标志物蛋白水平进行检测。结果发现，与对照组比较，MyoD1、Myf5、MEF2C、Myogenin 在补骨脂素组中表达上调（＜0.05），见图4、5。

3 讨论

补骨脂素可改善去卵巢小鼠模型骨代谢水平[8]。由于骨质疏松症实验受试对象多是去卵巢，雄性动物参与此类实验少，所以我们选择雄性动物为观察对象。另外，由于市面上骨折实验阳性药多针对破骨成骨细胞，对成肌分化研究较少，尚无针对成肌分化有说服力阳性药，因此实验未增添阳性对照组。

中医中并无对骨质疏松性骨折明确论述。由于骨折为骨质疏松疾病并发症，因而可归为“骨痹”、“骨萎”等范畴。虽传统文献无从脾论治记载，但有脾-肌肉-骨紧密联系的认识。骨肉不相亲理论正是对骨骼和肌肉之间关系的概括。肾为先天之本，主骨生髓。肾髓充实滋润四肢百骸。脾是后天之本，主肌肉和运化水谷。脾功能正常，气血生化有源，化生津液输布全身。灌溉五脏六腑，滋润肌肉骨骼。脾肾失常，骨骼和肌肉失去濡养[8]。一些研究者认为，骨骼与肌肉关系不局限于机械偶联，还有分子水平联系[9]。骨可作为内分泌器官释放骨钙素等因子，增加未羟丙基化骨钙素在血液中水平，对肌肉强度产生直接影响[10]。此外，骨细胞分泌的成纤维细胞生长因子23（Fibroblast Growth Factor 23 ，FGF23 ）在血液循环中水平升高导致了心肌肥厚[11]。Hamrick 等[12]利用肌生长抑素缺陷模型研究肌肉质量增加对骨矿物含量的影响。他们发现，肌肉体积增大促进肌因子分泌，进而影响骨量。这些研究为骨与肌肉干扰提供了有力证据。总之，阐细胞（activated satellite cells,ASCs）。QSCs 特征是Pax7 表达，而非MyoG 或MyoD。在增殖过程中，分裂的卫星细胞通过上调MyoG 和下调Pax7，进到分化阶段，退出细胞周期，产生成肌细胞并相互融合成肌管，修复受损肌肉[13]。有研究[13]报道，MyoD-/-突变的小鼠由于延迟性肌源分化使肌肉质量减少。另外，这些小鼠体内成肌细胞并不能分化，也不能融合成肌管。这表明MyoD 表达是肌源性分化重要决定因素。成肌分化诱导主要依赖MyoD，其他肌源性调节因子也参与成肌分化。这些因子不仅对ASCs 调控基因表达程序起关键作用,而且在骨骼肌微环境中信息处理、肌肉形态等方面有重要影响[14]，因为它们诱导的绝大部分靶基因是肌肉特异性结构和收缩性基因。因而我们选择MyoD1、MEF2C、Myf5 和Myogenin作为成肌分化标志性因子。

在微环境受到破坏后，激活的骨骼肌卫星细胞不仅可以融合和修复受损的肌纤维，还具有直接或间接的成骨潜力。有研究证实[15]，在没有肌肉骨骼创伤的情况下，MyoD 的表达仅限于骨骼肌。骨折发生后，MyoD 系肌源性细胞便会被招募到骨损伤的位置，这可能由于骨膜破坏和局部组织创伤。肌肉损伤可促进异位骨形成。研究者使用局部麻醉剂诱导肌肉退化，随后卫星细胞增殖激活。当肌肉植入脱矿骨基质明胶后发现有较强的骨反应[12]。还有研究者将携带骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP）基因的腺病毒直接注射到比目鱼肌中。相关染色反应显示肌纤维内有较强骨形成标志物受体表达[13]。这表明卫星细胞能够对BMP 刺激做出反应，从而产生成骨反应。利用这种现象，人们也许可以通过物理或化学方式诱导骨损伤附近肌肉创伤，增加成骨反应。

综上，本实验使用去睾丸骨折模型，研究补骨脂素对成肌分化标志性基因的影响，从成肌分化角度动态观察胫骨和肌肉修复情况。结果表明，补骨脂素提高成肌分化特异性基因表达水平，刺激肌肉修复，加快骨质疏松性骨折骨痂形成。一方面通过刺激卫星细胞分化，加快骨骼肌和骨骼修复。另一方面，补骨脂素补先天精气、促脾胃运化，使药物更有效被吸收发挥作用。本研究以中药改善骨质疏松性骨折患者生活质量为关注点，旨在为医者提供新思路。然而，本次实验中也存在一些不足。首先对胫骨标本做了Micro-CT，未有皮质骨和松质骨定量数据，如皮质骨松质骨厚度、骨矿物含量，这些会使实验更有说服力。其次，药物剂量单一，补骨脂素促进骨质疏松性骨折愈合和其量效关系之间机制尚不明确，需进一步研究。