枸杞多糖通过下调miR-365抑制皮肤鳞癌A431细胞增殖的机制研究

陈姣蓉，王嘉琪，黄 征

皮肤鳞癌是继基底细胞癌之后另一常见的非黑色素性皮肤癌，好发于50岁以上的老年人，多见于手背、头皮和面部等光暴露部位，可发生恶性转移危及患者的生命安全[1-2]。目前，手术根治性切除仍是皮肤鳞癌治疗的重要手段，但随着人们生活水平的提高，患者对术后要求不断升高，如何最大限度地改善和保留病灶处的功能与外观是近年来的研究热点之一。枸杞多糖(LBP)是常用补益中药枸杞的主要活性成分之一，已被证实在膀胱癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤疾病中表现出较好的抗肿瘤作用[3-6]，但LBP与皮肤鳞癌的相关研究鲜有报道。因此，本研究采用不同浓度的LBP处理人皮肤鳞癌A431细胞，观察其对细胞增殖的影响，并探讨可能的分子机制，以期为皮肤鳞癌的治疗提供新的方向和线索。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器 人皮肤鳞癌细胞株A431细胞购于中科院上海细胞库，LBP(纯度90%)购于南京景竹生物公司。胎牛血清、DMEM培养基购于美国Gibco公司，胰蛋白酶、MTT试剂购于美国Amresco公司，RIPA裂解液购于上海碧云天公司，LipofectamineTM2000、Trizol试剂、反转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购于大连TaKaRa公司，miR-365mimics及其阴性对照miR-NC购于上海吉玛生物公司。miR-365和U6内参检测试剂盒购于上海诺论生物医药公司。Bax抗体、Bcl-2抗体购于美国Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记二抗和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于江苏碧云天公司。MCO18AIC型CO2培养箱购于日本SANYO公司，MK3型多功能酶标仪购于上海Thermo公司，Gel Doc 2000凝胶扫描仪购于美国BIO-RAD公司。

1.2细胞培养 采用添加10%胎牛血清和50 μg/ml青链霉素的DMEM培养基于CO2培养箱(温度37℃、湿度饱和、CO2体积分数5%)常规培养A431细胞。实验所有细胞均为对数生长期细胞。

1.3实验分组与细胞转染 ①LBP影响A431细胞增殖实验：根据LBP药物浓度不同将A431细胞分为4组，分别为0、250、500和1000 mg/L组。②miR-365作用实验：将A431细胞分为Con组(未给予LBP处理)、LBP组(给予1000 mg/L的LBP处理48 h)、LBP+miR-NC组(转染miR-NC 24 h后给予1000 mg/L的LBP处理48 h)和LBP+miR-365组(转染miR-365mimics 24 h后给予1000 mg/L的LBP处理48 h)。③细胞转染：将A431细胞以适当密度接种至6孔细胞板上，置于CO2培养箱中常规培养过夜。待细胞汇合度达80%左右时，将miR-365 mimics和miR-NC参照LipofectamineTM2000说明书步骤转染至A431细胞中。转染4 h后，更换新鲜培养液继续培养24 h。

1.4MTT法检测A431细胞增殖 以胰蛋白酶消化收集待检测的A431细胞，以每孔4000个细胞接种于96孔板上。每组设5个平行孔。CO2培养箱内培养所需时间后，取出培养板，加入5 g/L的MTT试剂继续培养4 h后，再加入200 μl二甲基亚砜震荡反应10 min。多功能酶标仪在570 nm处检测各组细胞吸光度值。以药物处理组与空白对照组吸光度值的比值表示细胞活力。实验重复3次。

1.5RT-PCR检测A431细胞中miR-365的表达 收集待检测的A431细胞，加入Trizol试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA反转录合成cDNA。取模板cDNA 2 μl，加入浓度为5 pmol/ml的上下游引物各2 μl、SYBR Green Mix(2×)25 μl和ddH2O 21 μl配成50 μl的反应体系；按照95℃ 300 s，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s(共40个循环)的反应条件，参照miR-365和U6内参检测试剂盒说明书进行扩增，采用2-ΔΔCt法计算A431细胞中miR-365的表达。

1.6Western blot检测A431细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达 向待测的A431细胞中加入RIPA裂解液抽提总蛋白。以BCA法对总蛋白定量后，加入2×蛋白上样缓冲液沸水浴加热5 min。参照试剂盒说明书配制SDS-PAGE凝胶后，放入电泳槽内，按照每孔50 μg变性蛋白上样至凝胶孔中，以80 V电压电泳20 min后换成120 V电压至电泳结束。以100 mA恒流电转印至PVDF膜后，取出膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中摇床孵育2 h。以1∶1000的一抗工作液4℃孵育24 h后，1∶2000的二抗工作液室温孵育1 h。滴加发光剂显影、曝光，采用凝胶成像系统扫描分析。

2 结果

2.1LBP对A431细胞增殖的影响 与0 mg/L组比较，250 mg/L组A431细胞增殖无显著影响(P>0.05)，而500和1000 mg/L组能够呈时间-剂量依赖性抑制A431细胞增殖(P<0.05)。见图1。

图1 不同浓度和时间LBP对A431细胞增殖的影响

图2 不同浓度LBP对A431细胞中miR-365表达的影响

2.4miR-365表达对LBP调控A431细胞增殖的影响 与Con组比较，LBP组和LBP+miR-NC组细胞的增殖活力均显著降低(P<0.05)；与LBP组比较，LBP+miR-NC组细胞增殖活力无显著变化(P>0.05)，但LBP+miR-365组的细胞增殖活力显著升高(P<0.05)。见图4。

图4 miR-365表达对LBP调控A431细胞增殖的影响

2.5miR-365过表达对LBP调控A431细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 与Con组比较，LBP组和LBP+miR-NC组细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低，而Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与LBP组比较，LBP+miR-NC组细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平无显著改变(P>0.05)，但LBP+miR-365组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高，而Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图5。

图3 转染后各组A431细胞中miR-365的表达水平

图5 miR-365过表达对LBP调控A431细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

3 讨论

中药枸杞子是茄科宁夏枸杞的成熟果实，具有滋补肝肾和益精明目的功效[7]，还被证实具有抗氧化、抗衰老、降血糖和抗肿瘤等药理作用[8-10]；LBP是枸杞子的主要活性成分，因具有来源广泛，不良反应低和不易产生耐药等优势，逐渐引起肿瘤研究学者们的关注。在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠体内实验中，LBP可通过抑制肿瘤细胞增殖和血管生成等作用抑制乳腺癌的生长和转移[11]。体外细胞培养实验中，LBP可通过下调基质金属蛋白酶-2/9和抑制上皮间充质转化从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移[12]；LBP还可通过诱导细胞凋亡和自噬抑制人舌鳞癌CAL-27细胞增殖[13]。本研究以不同浓度(0、250、500和1000 mg/L)LBP处理皮肤鳞癌A431细胞不同时间后发现，500、1000 mg/L的LBP能够呈时间-剂量依赖性抑制A431细胞增殖。结果表明，LBP可通过抑制癌细胞增殖发挥抗皮肤鳞癌的作用。

除上述作用外，LBP还可通过激活Nrf2对紫外线照射引起的人皮肤成纤维细胞和人角质形成细胞损伤等具有较好的保护作用[14-15]。微小RNA是一类长约22个核苷酸的RNA分子，与多种人类疾病的发生相关[16-17]。既往研究证实，过度的紫外线照射是导致皮肤鳞癌发生的重要原因[18-20]，而紫外线照射可引起miR-365表达升高，高表达的miR-365可通过靶向核因子I/B在皮肤鳞癌的发生发展过程中发挥着重要的促进作用[21-22]；另外以抗miR-365寡核苷酸作用后可通过诱导细胞周期阻滞G1和细胞凋亡抑制皮肤肿瘤的形成[23]。为了探讨LBP抗皮肤鳞癌的分子机制，本研究进一步检测miR-365的表达。结果发现，500、1000 mg/L的LBP能够呈剂量依赖性抑制miR-365的表达。这提示miR-365可能参与了LBP调控皮肤癌细胞增殖的过程。为了进一步探讨miR-365在皮肤癌细胞增殖中的作用，本研究将miR-365mimics转染至A431细胞中，给予1000 mg/L的LBP处理，结果检测到成功上调miR-365表达可有效逆转LBP对A431细胞增殖的抑制作用；同时，还可有效逆转LBP引起的抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低和促凋亡蛋白Bax表达升高[24-26]。上述结果表明，miR-365通过调控Bcl-2和Bax蛋白的表达抑制LBP诱导的细胞凋亡。提示miR-365参与了LBP抑制皮肤鳞癌细胞增殖的分子过程。

综上所述，LBP可抑制皮肤鳞癌A431细胞增殖，其作用机制可能与LBP抑制miR-365的表达有关。