超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法测定梅花鹿茸中总游离氨基酸与游离氨基酸含量*

臧彬如，周改莲，单国顺，贾天柱，孟莉

(1.广西中医药大学药学院，广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530001；2.辽宁中医药大学药学院，大连 116600；3.辽宁省中医药研究院，沈阳 110034)

鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者习称花鹿茸，后者习称马鹿茸，其味甘、咸，性温，归肾、肝经，功效壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒，多用于治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、羸瘦、神疲、眩晕、耳鸣等证[1-4]。现代药理研究表明，氨基酸类成分是鹿茸有机成分中含量最高的营养物质[5]，具有良好的营养支持和降血糖作用[6]。当机体摄入鹿茸后，其中的蛋白质和肽类物质便可分解成小分子肽类和氨基酸以供机体吸收，从而使氨基酸发挥生物学活性[7]。梅花鹿茸中氨基酸类成分含量测定方法已有薄层扫描法[3]、高效液相色谱法[8]、氨基酸自动分析[9]等，但由于薄层扫描法用于定量的准确性、稳定性和精密度较差，氨基酸自动分析法不能检测脯氨酸且所用仪器复杂，价格较昂贵。同时，在实验前期通过液相色谱测定，分离效果差，抗干扰能力弱，准确性不高[10]，且测定鹿茸中16种氨基酸类成分所用时间较长，多成分含量同时测定色谱条件摸索较困难复杂[11]，因此笔者在本实验采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法(ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS/MS)技术建立梅花鹿茸中游离氨基酸的含量测定方法，与传统氨基酸测定方法比较，该方法不仅准确、快速、重复性好，且专属性强，在固有设备特点中相较其他检测设备具有分析性能强、分析速度快、灵敏度高等特点[12]，可用于梅花鹿茸的质量控制，为该药材资源的综合利用与开发提供参考依据[13]。

1 仪器与试药

1.1仪器 ACQUITYTMUPLC I-Class系统，XEVO TQD型四极杆质谱仪和MassLynx 4.0质谱工作站软件(美国Waters公司)，UV-T6型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司，感量：0.01 mg)；METTLER AE240型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)，RO-2640P超纯水器。

1.2试药 蛋氨酸(批号：DST180402-098)、脯氨酸(批号：DST170724-039)、谷氨酸(批号：DST180402-078)、组氨酸(批号：DST180719-069)、酪氨酸(批号：DST171013-261)、天冬氨酸(批号：DST180619-897)、赖氨酸(批号：DST170918-108)、异亮氨酸(批号：DST180619-899)、苏氨酸(批号：DST180723-135)、精氨酸(批号：DST180519-079)、苯丙氨酸(批号：DST180623-898)、缬氨酸(批号：DST070505-061)、色氨酸(批号：DST180603-134)、丝氨酸(批号：DST180526-190)、亮氨酸(批号：DST180613-124)、谷氨酰胺(批号：DST180712-896)对照品均购于成都德思特生物技术有限公司，上述对照品经高效液相色谱法(HPLC)检测，质量分数均>98%。茚三酮(大连美仑生物技术有限公司，批号：D1111A)。市售梅花鹿茸样品信息见表1，所有样品均经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为真品，均为鹿科动物梅花鹿Cervusnippon的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。水为超纯水，由RO-2640P超纯水器制备，乙腈、甲酸均为色谱纯(德国Merck公司)，其余试剂均为分析纯。

表1 市售梅花鹿茸样品信息

2 方法与结果

2.1总游离氨基酸的含量测定

2.1.1对照品溶液的制备 精密量取干燥至恒重的色氨酸对照品约12.5 mg，置25 mL量瓶，加超纯水稀释并定容至刻度，得0.505 g·L-1对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 取梅花鹿茸样品粉末(过三号筛，筛孔内径297 μm，下同)约1.0 g，精密称定，置锥形瓶，加70%乙醇10 mL，超声提取60 min，放冷，滤过，滤液加70%乙醇定容于25 mL量瓶，混匀，经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3线性关系考察 分别精密量取色氨酸对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置25 mL量瓶，分别用水补足1.0 mL，依次加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 值5.0)0.5 mL和3%茚三酮乙醇溶液0.5 mL，沸水浴加热20 min，取出，冷却至室温，加50%异丙醇溶液定容至刻度，摇匀，570 nm波长处测定吸光度(A)。以色氨酸质量浓度为横坐标，A为纵坐标，得回归方程Y=1.305X-0.023 1(r=0.999 6)，线性范围0.050 5～0.505 g·L-1。

2.1.4精密度实验 分别精密吸取同一供试品溶液(西丰县辽北种鹿场)约1.0 g，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，于570 nm波长处连续测定A值6次，计算得RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。

2.1.5稳定性实验 分别精密吸取同一供试品溶液(西丰县辽北种鹿场)约1.0 g，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，0.5，1.0，1.5，2 h后，按“2.1.3”项方法操作，于570 nm波长处测定A，计算得RSD为1.9%，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定性良好。

2.1.6重复性实验 分别精密吸取同一供试品溶液(西丰县辽北种鹿场)约1.0 g，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项方法操作，于570 nm波长处测定A，计算得RSD 为3.3%，表明该方法重复性良好。

2.1.7回收率实验 分别精密吸取同一供试品溶液(西丰县辽北种鹿场)约0.5 g，共6份，精密称定，分别加入色氨酸对照品溶液适量，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项方法操作，于570 nm波长处测定A，计算得平均加样回收率为98.9%，RSD为2.1%，表明该方法回收率良好。

2.2游离氨基酸的含量测定

2.2.1色谱条件 ACQUITY BEH Amide色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，以20 mmol·L-1乙酸铵水溶液-含0.5%甲酸的乙腈溶液(15：85)为流动相A，含0.5%甲酸的20 mmol·L-1乙酸铵水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～0.5 min，100%A；0.5～2.5 min，100%→96%A；2.5～3.5 min，96%→80%A，3.5～4 min，80%→62%A；4～6 min，62%→55%A；6～6.5 min，55%→100%A)；柱温35 ℃；流速：0.6 mL·min-1；进样量1.5 μL。

2.2.2质谱条件 离子源为电喷雾离子源(electrospray ion source，ESI)，负离子模式采集，数据采集范围m/z50～1000，毛细管电离电压2.0 kV，脱溶剂气温度300 ℃，脱溶剂气流量600 L·h-1，锥孔气流量50 L·h-1，喷雾气氮气(N2)，采集模式为多反应监测模式(multimedia reaction monitoring mode，MRM)，详细质谱条件见表2。

2.2.3对照品溶液的制备 分别精密称取对照品溶液适量，以超纯水溶解并定容于25 mL量瓶，摇匀，制成含丝氨酸0.053 mg·mL-1、脯氨酸0.051 mg·mL-1、缬氨酸0.058 mg·mL-1、苏氨酸0.044 mg·mL-1、亮氨酸0.061 mg·mL-1、天冬氨酸0.059 mg·mL-1、谷氨酸0.048 mg·mL-1、赖氨酸0.05 mg·mL-1、组氨酸0.049 mg·mL-1、苯丙氨酸0.068 mg·mL-1、精氨酸0.046 mg·mL-1、酪氨酸0.055 mg·mL-1、色氨酸0.045 mg·mL-1、谷氨酰胺0.062 mg·mL-1、异亮氨酸0.047 mg·mL-1、蛋氨酸0.063 mg·mL-1、次黄嘌呤0.066 mg·mL-1的对照品储备液，密封避光保存。

2.2.4供试品溶液的制备 取梅花鹿茸样品粉末适量(过三号筛，筛孔内径297 μm)，精密称取约1.0 g，置具塞锥形瓶，精密加入超纯水20 mL，超声提取10 min，9500 r·min-1离心10 min(r=13.5 cm)后取上清液，残渣加超纯水20 mL继续超声提取，如此反复3次，合并上清液，加超纯水定容于100 mL量瓶，混匀，经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.5线性关系考察 分别精密量取各对照品储备液适量，用超纯水稀释制得系列对照品溶液。按“2.2.1”及“2.2.2”项色谱条件测定，以各对照品的质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。按信噪比(S/N)=3计算检测限(limit of detection，LOD)，S/N=10计算定量限(limit of quantitation，LOQ)。结果表明各对照品质量浓度在一定范围内与峰面积呈良好线性关系，见表3和图1。

表3 梅花鹿茸中16种游离氨基酸的线性范围考察

1.组氨酸；2.精氨酸；3.丝氨酸；4.赖氨酸；5.谷氨酰胺；6.天冬氨酸；7.苏氨酸；8.谷氨酸；9.脯氨酸；10.酪氨酸；11.缬氨酸；12.蛋氨酸；13.异亮氨酸；14.亮氨酸；15.苯丙氨酸；16.色氨酸。

Fig.1UPLC-MS/MSspectrumofmixedreferencesolution

2.2.6精密度实验 分别精密吸取同一浓度混合对照品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”项条件连续测定6次，计算得16种氨基酸峰面积RSD为1.4%～4.2%，表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性实验 分别精密吸取同一供试品溶液(西丰县辽北种鹿场)约1.0 g，按“2.2.4”项方法制备供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，24 h按“2.2.1”和“2.2.2”项条件测定，结果16种氨基酸峰面积RSD为2.5%～4.9%，表明该方法在24 h内稳定性良好。

2.2.8重复性实验 分别精密吸取同一供试品溶液(西丰县辽北种鹿场)约1.0 g，按“2.2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”项条件测定，结果16种氨基酸质量分数的RSD为1.8%～4.7%，表明该方法重复性良好。

2.2.9回收率实验 分别精密称取已知各氨基酸含量的梅花鹿茸样品(西丰县辽北种鹿场)约1.0 g，共9份，分别精密加入低(80%)、中(100%)、高(120%)3个水平对照品适量，每个水平3份，按“2.2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”项条件测定，结果16种氨基酸平均加样回收率97.7%～99.8%，RSD为1.2%～2.6%。结果见表4。

2.3样品测定 精密称取15个厂家市售梅花鹿茸样品，按“2.2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项方法及仪器条件测定总氨基酸和16种游离氨基酸的含量，测定结果见表5和图2～4。

3 讨论

目前报道的梅花鹿鹿茸质量控制方法包括紫外分光光度法[14]、红外光谱法[15]、薄层色谱法[3]、高效液相色谱法[8]、高效液相色谱-质谱联用法[16]、气相色谱法[17]、气相色谱-质谱联用法[18]及分子生物等多种技术。梅花鹿茸中常用于质量控制的指标有蛋白质[19]、多糖[20]、氨基酸、多肽[21]等，其中氨基酸含量非常丰富[22]，且梅花鹿茸中的氨基酸可促进人体蛋白质合成，加快糖酵酶分解，提高人体造血能力。现代研究表明，有关梅花鹿茸的研究主要集中在氨基酸含量测定方面，但采用的方法多为紫外分光光度法和色谱法[23]，不能较直观地反映梅花鹿茸中氨基酸含量变化情况。UPLC-MS作为一种新的分析技术，其质谱采用特定离子对扫描模式，样品中杂质不会对待测成分产生干扰，且克服了UPLC分离度差的问题，检测信号高[24]，在短时间内即可达到有效分离[25]，拥有更低的定量下限[26]，从而被广泛应用于天然产物的分析，更适合应用于梅花鹿茸药材质量控制和综合评价[27]。

表4 梅花鹿茸中16种游离氨基酸的加样回收率实验结果

续表4 梅花鹿茸中16种游离氨基酸的加样回收率实验结果

表5 市售梅花鹿茸样品中总游离氨基酸及16种游离氨基酸的含量

图2 主成分分析

图3 偏最小二乘-判别分析

因此，笔者在本实验采用UPLC-QqQ-MS/MS技术建立梅花鹿茸中游离氨基酸的含量测定方法，结果显示该方法不仅操作简单、灵敏度高、专属性强、分析效率高，且还可以明确各种氨基酸的含量情况，更有利于对梅花鹿茸的质量进行控制[28]。

3.1离子模式的选择 氨基酸作为两性化合物，其结构中同时包含氨基及羧基。理论上，ESI源下的含氮化合物本身在正离子模式下容易离子化，而羧基结构则更容易在负离子模式下进行离子化。本研究中为了得到更高的离子化强度，分别考察了不同氨基酸在正负离子模式下的响应强度，结果发现鹿茸中的16种氨基酸在负离子模式下的响应强度均强于正离子模式。

图4 VIP得分图

3.2色谱柱的选择 由于氨基酸类化合物极性均较强，在反相C18色谱柱上多为弱保留，因而都很快随流动相流出，无法得到良好的分离。因此，为更好地对氨基酸类成分进行分离和分析，笔者采用反相Amide杂化硅胶键合相色谱柱，实现了对氨基酸类成分的良好分离。

3.3流动相的选择 本实验前期研究中先后尝试使用不同比例的甲酸水和甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱，但由于色谱峰的拖尾现象较为严重，考虑到目标化合物的极性特征。因此，在流动相中尝试加入乙酸铵来改善色谱峰的峰形，结果取得满意的效果。

3.4提取方式的选择 梅花鹿茸样品提取方法，笔者先后采用回流法和冷浸法，但上述两种方法对氨基酸类物质的提取效率均较低，且回流法所用时间较长，方法重复性较差。因此，笔者又尝试了超声提取法，结果方法的提取时间短，提取效率高，方法重现性好，适合作为梅花鹿茸样品的提取方法。

笔者在本实验采用UPLC-QqQ-MS/MS技术建立鹿茸中游离氨基酸的含量测定方法，并对15个厂家的市售梅花鹿茸样品进行含量测定[22]。结果显示，不同厂家梅花鹿茸样品中，氨基酸的组成和含量上均存在一定的差异。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)，结果从PCA图中可以看出梅花鹿茸样品可分为两类。其中，绿色部分为S2、S3、S4、S5、S6、S11和S12的梅花鹿茸样品，红色部分为S1、S7、S8、S9、S10、S13、S14和S15的梅花鹿茸样品，结合数据分析可见，红色部分为合格样品，绿色部分为不合格样品。进一步采用偏最小二乘-判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，合格样品与不合格样品得到很好的分类，结合VIP得分图中所示VIP值(选择VIP值>1的成分作为起主要作用的成分)的情况可知，总游离氨基酸对梅花鹿茸的品质影响最大，同时，赖氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和谷氨酸也对梅花鹿茸的品质有一定的影响。这可能与不同产地梅花鹿茸的采收和加工方式有关。因此，有必要在以后的研究中对梅花鹿茸的炮制工艺做进一步优化，以保证梅花鹿茸饮片质量的稳定可靠。鉴于目前梅花鹿茸中的活性成分不明确，药效机制不明晰，梅花鹿茸中活性成分的确定以及相关药效机制的研究都值得进一步研究。