HPLC 测定山西不同产地野生款冬花中款冬酮的含量

刘计权，张志芳，王亚君，王艳凤

（山西中医药大学，山西晋中030619）

●中医药学在世界上首先发现了中药并首创了方剂，医方是“除疾 保性命之术”，而剂则有“调百药齐，和之所宜”之功。采用现代药物制剂技术重新研究并升华古典方剂之术，开创未来药物制剂技术和新剂型药物研究的全新思维和方向。

款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，每年12 月或地冻前当花尚未出土时采挖，除去花梗及泥沙，阴干入药［1］。款冬花具有润肺下气、止咳化痰等功效，临床上用于新久咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血等，在中成药生产中，款冬花又是通宣理肺丸、百花定喘丸等几十种中成药的重要原料［2］。

款冬花入药始载于秦汉时期的《神农本草经》，列为中品，它的药用价值、历史渊源历代医家多有论述，除我国药用外，欧美和北美洲均有以款冬的花蕾、花、叶和根治疗咳嗽、感冒的记载［3］。

款冬花适应性极强，广布于我国南北各省区，其中道地产区为河北、山西、陕西以及甘肃［4-5］。款冬花所含成分包括黄酮类、萜类、酚类、生物碱类等［6-7］，款冬酮是 2015 版《中国药典》规定的指标性成分。

2009 年2 月，国家中药现代化科技产业（山西）基地建设规划实施方案中将款冬花和连翘、苦参、党参、黄芪、远志、柴胡、山楂、酸枣仁列为山西重点发展的九大中药材种植品种。2016 年6 月18日，“国家中药标准化项目”正式在山西启动，该项目将制定中药材、中药饮片、中成药生产规范及标准，会上确定款冬花和连翘、苦参、党参、黄芪、远志、柴胡、山楂、酸枣仁为山西省承担的“国家中药标准化项目”中的九大中药品种。

本研究采用HPLC 法，测定了山西不同产地野生款冬花中款冬酮的含量，以期为山西野生款冬花的质量评价提供参考依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

日立高效液相色谱仪（Pump 5110；Auto sample 5210；Column oven 5310；Diode array detector 5430）［日立高新技术（上海） 国际贸易有限公司］、EX125ZH 电子天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司］、202A-1 电热干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司）、FW-200 高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）、DZKW-4 双孔电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）、SCQ-140701P 超声提取仪（上海声彦超声波仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物

款冬酮对照品（111884-201704）购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，乙醇，蒸馏水等。

野生款冬花药材采自山西境内13 个县，经鉴定均为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。款冬花药材来源信息见表1。

表1 野生款冬花来源信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相采用甲醇-水溶液（85∶15）等度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃；检测波长220 nm，进样量10 μL。对照品溶液和供试品溶液HPLC 色谱图见图1。

图1 款冬HLPC 色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取款冬酮对照品5.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至10 mL。精密吸取上述溶液1.0 mL 移入10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，摇匀，制成浓度为52 μg/mL 的款冬酮对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取款冬花药材，除去花梗、泥沙等非药用部分，在50 ℃烘箱中烘干至恒重。将烘干的药材粉碎后过4 号筛，取过筛后的款冬花药材粉末约1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入乙醇50 mL，称定重量，浸泡30 min，回流提取1 h，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取款冬酮对照品溶液 1、3、6、9、12 μL，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，款冬酮的回归方程为y=2 631 856.73x-4617.38，r=0.9993。表明款冬酮在 0.52～6.24 μg 内线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取款冬酮对照品溶液10 μL，连续进样6 次，测定峰面积积分值，结果得RSD 为1.57%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取同一批款冬花供试品溶液，按2.1 项下色谱条件，分别于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 进行测定，记录款冬酮峰面积，求得RSD 为0.98%。结果表明供试样品溶液在10 h 内稳定性良好。

2.7 重复性实验

精密称取同一批款冬花药材粉末6 份，每份约1.0 g，精密称定，按2.3 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件，依次进样10 μL 进行测定，测得款冬花药材中款冬酮的平均含量为1.06 mg/g，RSD 为1.28%，表明该实验方法的重复性良好。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的同一批款冬花药材粉末6 份，每份约0.5 g，于每份药材粉末中分别加入浓度为0.52 mg/mL 的款冬酮对照品溶液1 mL，分别按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件依次进行测定，计算款冬酮的平均加样回收率为98.03%，RSD 为1.56%，表明该方法的回收率良好。结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

2.9 样品含量测定

将13 个产地的款冬花药材按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件，分别取样10 μL 注入高效液相色谱仪，测得峰面积值，根据线性方程计算款冬酮的含量。结果见表3。

由表中测定结果可知，不同产地野生款冬花药材中款冬酮的含量不同，其中以五寨县款冬花药材中款冬酮的含量最高（1.64 mg/g），夏县款冬花药材中款冬酮的含量最低（0.73 mg/g）。2015 版中国药典中规定，款冬花药材中款冬酮的含量不得少于0.70 mg/g［1］，山西野生款冬花药材中款冬酮的含量均符合药典规定的标准。

表3 样品含量测定结果

3 讨 论

在供试品溶液的制备中，提前浸泡30 min，料液比为1∶20，比较了回流提取1 h 与超声提取（功率200 W，频率40 kHz）1 h 对款冬酮含量的影响，以回流提取法制备的供试品溶液中款冬酮的含量较高。在回流提取中，考察了 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 不同料液比对款冬酮含量测定结果的影响，其中以料液比为1∶50 回流提取制备供试品溶液中款冬酮的含量最高。最终确定款冬花药材供试品溶液的制备方法为料液比为1∶50、提前浸泡30 min、回流提取1 h。

中药材有效成分的形成、转化与积累，受到环境条件的深刻影响，其中环境条件的影响主要与经纬度、海拔高度、温度、光照强度和土壤密切相关［8］。本研究在采集款冬花药材的过程中发现，野生款冬花分布环境多样，既有土层深厚、有机质丰富的林下、山脚下，也有土壤贫瘠的路边、河滩、砂砾，不同生境在经纬度、海拔、土壤条件等方面存在一定的差异性，生境中共同的特点是土壤潮湿，所以土壤水分是影响其分布的重要因素。不同产地款冬花药材中款冬酮含量的差异性是多种环境因子综合作用的结果。