远志抗凝血作用的物质基础研究

李 娟 ，张 璇 ，陈彤垚 ，王倩玉 ，3，杜晨晖 ，秦雪梅 ，张福生 ，马存根

（1.山西药科职业学院药学系，山西太原030031； 2.山西大学中医药现代研究中心，山西太原030006；3.山西大学化学化工学院，山西太原030006； 4.山西中医药大学，山西晋中030619）

远志，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国重要的大宗中药材之一。远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd. 或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根，在我国应用历史悠久，其性味苦、辛、温，归心、肾、脾经，具有安神益智［1］、祛痰［2］、消肿等功效，常用于治疗失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚、咳痰不爽、疮疡肿毒、乳房肿痛等［3］。目前，远志属其他药用植物在全国不同地区应用广泛，如长毛籽远志（P.wattersii Hance.）、华南远志（P.glomerata Lour.）、香港远志（P.hongkongensis Hemsl.）等均具有活血、化瘀作用［4-8］。但有关远志发挥抗凝血作用的物质基础研究尚为空白，罕见报道。

本研究采用回流提取和溶剂萃取法得到远志不同极性部位，使用经典的毛细管法测定小鼠凝血时间，筛选并比较了远志抗凝血作用的有效部位。并采用高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析对上述提取、分离的各部位进行了化学成分差异研究，探讨了中药材远志发挥抗凝血作用的物质基础，以期为开发远志新的临床用途提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药材

1.1.1 实验动物 品系：SD 小鼠；性别：雄性；体质量：18~22 g；来源：北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK2011-0012，饲养：清洁级动物房常规饲养。置于自然昼夜节律光照条件下，自由进食、饮水，适应性饲养1 周后进行实验。

1.1.2 实验药物 远志筒药材（Polygala tenuifolia）购买于河北安国药材市场，样品经山西大学中医药现代研究中心张福生副教授鉴定为正品。阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司，批号20130078）。

1.1.3 试剂与仪器 Polygalaxanthone Ⅲ（MUST-14100905，纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司）；3，6′-disinapoyl sucrose（16011921，纯度为98%成都普瑞法科技开发有限公司）；95%乙醇（分析纯），石油醚（分析纯），乙酸乙酯（分析纯），正丁醇（分析纯），以上试剂均为北京化工厂生产。

Waters e2695 高效液相色谱仪（配自动进样器、四元梯度泵、柱温箱、UV 检测器；色谱柱为Venusil Agela MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。GCMS 联用仪（Agilent 5977 B 气质联用仪，G4513A自动进样器，四级杆质量分析器）；HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。旋转蒸发仪（RE-52A）上海亚荣生化仪器厂，正空干燥箱（DZF-1B）上海跃进医疗机器厂，调温电热套（ZDHW）北京市光明医疗仪器厂，超声波清洗器（KQ5200E）昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 远志药材传统水提取物的制备 称取30 g远志药材（剪短至1~2 cm），置500 mL 的圆底烧瓶中，加入10 倍量蒸馏水（300 mL），加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，用抽滤瓶抽滤，滤液浓缩至一定体积，得水提物。

1.2.2 远志药材不同极性部位的制备 称取250 g远志药材（剪短至1~2 cm），加10 倍量80%乙醇（2500 mL）浸泡过夜，加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，用抽滤瓶抽滤，滤液减压回收至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对滤液各萃取3 次，回收溶剂，浓缩至浸膏，60 ℃真空干燥，分别得石油醚部位（部位A）、乙酸乙酯部位（部位B）、正丁醇部位（部位 C）、萃取水部位（部位 D）［9］，结果见图1。部位A、B、C、D 分别溶于0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，分别配制成浓度为0.013 15 g/mL、0.007 13 g/mL、0.056 21 g/mL、0.044 47 g/mL 的溶液。

图1 远志不同极性部位的制备流程图

阿司匹林溶液（阳性对照）：使用时取阿司匹林片适量，用研钵磨成粉末，加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液适量，配制成浓度为1.271 mg/mL的溶液。

1.2.3 分组与给药 取小鼠70 只，随机分为7组，每组10 只。随机分为空白组（0.5%的羧甲基纤维素钠溶液）、阿司匹林对照组、A 组、B 组、C 组、D组、E 组（水提物对照组），灌胃给药体积0.1 mL/10 g，远志成人临床用药剂量为3~10 g/60 kg，各部位所配剂量为人用最大剂量的 30 倍，即 5 g/kg［9］。

1.2.4 小鼠凝血时间的测定 对小鼠连续给药8 d，于末次给药 1 h 后，用长 7～10 cm、内径 1 mm 的玻璃毛细管（上海新朋玻璃仪器有限公司，规格：0.9~1.1 mm，长度：10 cm，数量：500 根）插入小鼠眼内眦后静脉丛中，深约4～5 mm，轻轻转动再缩回，自血液流入毛细管内开始计时，血液注满后取出毛细管平放于桌上，每隔约30 s 依次折断毛细管的两端（约0.5 cm），并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝出现为止，所经历时间即为凝血时间［10］，数据的平均值即为该小鼠的凝血时间。

1.3 统计学方法

实验数据以均数±标准差（x±s）表示，运用SPSS 16.0 软件进行统计分析，数据间比较采用独立样本t 检验。

2 结 果

2.1 远志不同极性部位的HPLC 分析

液相条件：流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）梯度洗脱，洗脱梯度如下：20：80→24：76（0～10 min），24：76→28：72（10～30 min），28：72→31：69（30～35 min），31：69（35～45 min），31：69→35：65（45～50 min），35：65→40：60（50～51 min），40：60→43：57（51～64 min），43：57→20：80（64～68 min）；检测波长：316 nm；采集时间：68 min；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；理论塔板数：以 3，6′-二芥子酰基蔗糖计不低于3000。

2.2 远志不同极性部位的GC-MS 分析

分别称取A、B、D 部位50 mg，各加入10 mL的玻璃试管中，分别加入2 mL 的甲醇-浓硫酸（10∶1）混合溶液，60 ℃水浴加热 30 min，冷却至室温后，加入2 mL 正己烷与2 mL 蒸馏水振荡萃取，待分层清晰后，分离上清液（正己烷层）作为分析试样，进行GC-MS 分析。

2.3 小鼠凝血时间结果分析

阿司匹林、部位B、部位C、部位E 均能延长小鼠的凝血时间，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。虽然部位 B、部位 C、部位 E 均能延长小鼠凝血时间（P＜0.05）；与空白组相比，部位E的P 值为0.049，趋近于0.05；而部位B 与部位C的P 值则分别为0.018 和0.031；从P 值的大小来判断，上述3 个部位的抗凝血作用仍有较大的差异。按抗凝血活性的强弱排列：部位C＞部位B＞部位E。

但是部位C 组中有5 只小鼠先后出现死亡，经尸体解剖后发现，这5 只小鼠均出现了不同程度的胃肠道肿胀及肠胀气。结果见表1，图1。

表1 各提取部位对小鼠的凝血时间的影响

综上，本研究将中药材远志提取、分离成若干不同极性部位，经体内动物实验证明，部位B 和部位C 的抗凝血活性优于传统水提物（部位E）。由于部位C 中所含的皂苷类成分较多，可能会引起一些不良反应，诸如胃肠胀气或肠道坏死等。

2.4 远志各分离部位的HPLC 分析

在远志各分离部位的HPLC 图谱中，口山酮Ⅲ/3，6′-二芥子酰基蔗糖为对照品指认［11］。结果见图2。从图2 中可以看出远志各极性部位化学信息差异较大。部位B 与部位C 在①②区的化学成分种类及含量明显丰富其他部位。部位C 在③区与其他部位也明显不同，显示其皂苷含量明显高于其他部位。

部位A 在③皂苷区域几乎没有峰，在①口山酮区与②寡糖酯区峰个数微乎其微。部位B 在口山酮区与糖酯区的峰及其多，而皂苷区的峰相对比较少。部位C 在口山酮区与糖酯区的峰与部位B 的峰相似，但皂苷区的峰比远志药材甲醇提取物在此区域的峰个数都多，且含量较高。部位B、部位C 都有抗凝血作用，且前者的作用更优，因此可以推测远志药材抗凝血作用的有效部位应该主要集中在口山酮区和糖酯区。结果见图3。

图2 远志不同极性部位的HPLC 叠加色谱图

图3 远志不同极性部位的HPLC 色谱图

2.5 远志各分离部位的GC-MS 分析

从定性角度分析，A 部位与B 部位的总离子图基本相似，结合NIST14.0 数据库指认了含量均较高的棕榈酸（1）、亚油酸（2）、油酸（3）。此外，B部位中保留时间为21.25 的色谱峰高于A 部位，且B 部位中保留时间为23.02 和29.18 的色谱峰在A 部位中没有。而C 部位中不含有棕榈酸、亚油酸和油酸。结果见图4。

药效学实验表明，部位B 有抗凝血活性，而部位A 没有抗凝血活性。区别与部位A、部位B 中含有2 个含量相对较高的色谱峰，保留时间分别为23.02 min 和29.18 min，而这两个色谱峰可能与部位B 的抗凝血活性密切相关。结果见图5。

图4 远志不同极性部位的GC-MS 总离子流图

经查阅相关文献得知，桃仁活血化瘀的物质基础主要是油酸与亚油酸。故推测，远志中抗凝血作用的物质基础可能也与油酸和亚油酸相关，油酸、亚油酸在其中起到了一定的辅助作用［9］。

3 讨 论

本研究将远志药材提取、分离成若干不同极性部位，经体内动物实验证明远志乙酸乙酯部位、正丁醇部位与传统水提物均有一定的抗凝血作用，且乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗凝血活性优于传统水提物。本研究也进一步对远志药材不同极性部位进行了抗凝血药理活性研究，从HPLC分析结果来看，抗凝血作用的活性物质主要集中在口山酮区与糖酯区；从GC-MS 的结果来看，除了油酸和亚油酸以外，其他的脂肪酸类化合物应该也是远志发挥抗凝血作用的物质基础。由此可见，远志药材应该是通过多种活性成分协同作用，通过不同作用环节协同发挥了抗凝血作用。

《湖南省中药材标准》《河南省中药材标准》等地方标准均记载了远志不同属植物具有活血化瘀的药用功效［12-20］，如黄杨远志亚属中的黄花远志有补气活血等功效；小扁豆亚属中的长毛籽远志有活血、舒经散血等功效；远志亚属中的西南远志有活血止痛等功效。同科不同属间的植物药理作用应该相似［21］。因此本研究得出远志乙酸乙酯部位、正丁醇部位与传统水提物有一定的抗凝血作用这个结论与上述文献及地方标准的结论是保持一致的。

本研究仅对中药材远志抗凝血作用的物质基础进行了初步研究，因此远志具体的抗凝血活性机制还有待后续的研究。后续可针对远志的不同大类成分的抗凝血活性进行更全面的探索，以完善远志的抗凝血活性物质基础，为日后远志的临床应用奠定基础，以开拓其更为广阔的开发应用前景。