电针对MCAO 大鼠海马中CACNα1D 的影响

罗 来 ，徐芳媛 ，许金森 ，潘晓华 ，黄倩茹 ，万 隆

（1.福建中医药大学针灸学院，福建福州350108； 2.福建省中医药研究院，福建福州350003）

脑卒中是一种严重的神经系统疾病，也是世界第二大致死疾病，并且发病率呈逐年上升趋势，对全世界人民都造成了巨大的负担［1］。针灸治疗脑卒中在我国历史悠久，《针灸甲乙经》就有“偏枯，四肢不用，善惊，大巨主之”的记载，临床疗效也得到了广泛的认可，并且针灸疗法具有方法多样、经济简便、不良反应少的优点，适合在临床推广。对于针灸治疗脑卒中的机制目前众说纷纭，其中对钙离子通道的研究一直是一大热点，钙离子通道与心肌和血管平滑肌的功能正常与否有着重要的联系。有研究表明大脑内存在钙离子依赖性的神经递质分泌，可能在脑缺血再灌注后超级化激活环核苷酸门控阳离子通道通过增加钙离子内流，诱发神经元兴奋毒性，从而参与缺血再灌注损伤的分子机制［2］。因此，本研究通过观察电针对大脑中动脉闭塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的脑卒中症状的影响和缺血侧海马CACNα1D mRNA 表达来探讨电针治疗脑卒中的机制，为电针治疗脑卒中提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选用成年SD 雄性大鼠21 只，均由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，体质量（300±20）g，每笼 7只大鼠，均自由进食及饮水，适应性饲养1 周。饲养条件：温度（22±2）℃，湿度（55±15）%，12 h 明暗交替，自由进食与饮水。实验过程中均严格按照国际动物保护及使用指南的规定进行。

1.1.2 试剂与仪器 华佗牌30 号0.5 寸不锈钢毫针（中国上海）、SDZ-II 型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）、小动物呼吸麻醉系统（深圳瑞沃德生命科技公司，R407），L3800 号大鼠用MCAO 线栓（广州佳灵生物技术有限公司）、NANODROP RNA 质量检测仪（美国Thermo 公司）、海尔-80 ℃冰箱（中国山东）、ABI step one plus 荧光定量 PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）、q-PCR 试剂盒 （北京 TRAN 公司）、Fast Quantity RT Kit 逆转录试剂盒（北京天根生化科技公司，KR106）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 将18 只大鼠按随机数字表法分为电针组、模型组、假手术组。电针组和模型组参照 Longa 改良线栓法［3］，在大鼠左侧行MCAO手术，具体操作方法为：大鼠术前禁食不禁水12 h。将大鼠投入透明麻醉诱导盒中，体积为25 cm×12 cm×20 cm，开启异氟烷流量并调至500 mL/min，浓度调至5%，持续1 min，待大鼠呼吸平稳缓慢，缩爪反射消失后，将大鼠取出戴上呼吸面罩，并将流量调为300 mL/min，浓度调为3%，并根据术中大鼠对手术刺激的反应，适当调节浓度、流量以维持麻醉深度。将麻醉后大鼠四肢固定仰卧于手术板上，备皮消毒，暴露左侧颈部，取颈前正中切口，切开颈部皮肤，钝性分离左侧颈总动脉（Common carotid artery，CCA）、颈内动脉 （Internal carotid artery，ICA）、颈外动脉 （External carotid artery，ECA）。用缝合线在左侧ECA 远心端打一死结结扎ECA，动脉夹夹闭ICA、ECA，双极电凝器电凝ECA 分支，在 ECA 距 CCA 分叉 1 cm 处剪开一个小口，将线栓缓慢沿ECA 插入ICA，在剪口处向下约2 mm 处使用缝合线打一活结略微绑紧ECA，之后剪断ECA 并将残端反折以使线栓插入ICA，遇到轻微阻力时即停止插入，进线深度为18~22 mm，再将ECA 残端的活结打死防止线栓脱出。缝和伤口并消毒，2 h 后轻柔回抽线栓至CCA 分叉处，减去线栓的体外部分，实现再灌注损伤。假手术组只将颈部皮肤剪开，钝性分离CCA、ICA、ECA 后即缝合，不予结扎和插线。保持室温为25 ℃左右，直至大鼠苏醒。

1.2.2 干预措施 电针组参考《实验针灸学》［4］选取大鼠“神庭”“百会”穴，选用华佗牌30 号0.5 寸不锈钢毫针向上斜刺0.2~0.3 cm，连接SDZ-II 电针仪，电流设置1.5~2.0 mA，以针体轻微抖动且大鼠耐受为度，选取疏密波，频率2~5 Hz，每次20 min，术后24 h 开始进行干预，连续7 d。模型组和假手术组行同等条件抓取后回笼，不予治疗。

1.3 标本采集与检测

1.3.1 神经功能缺损评分 在手术后第1 天和第7 天对3 组大鼠进行神经功能缺损评分。大鼠苏醒后，参照Zea-Longa 5 分法进行神经功能缺损评分，判断造模情况［5］。0 分：没有神经功能缺损；1分：未能完全伸展右侧（患侧）前爪，提示轻度神经功能缺损；2 分：行走时向右侧转圈，提示中度神经功能缺损；3 分：行走时向左侧倾倒，提示重度神经功能缺损；4 分：不能自主行走，并且意识水平较低。选取1~3 分的大鼠，剔除0 分和4 分大鼠。

1.3.2 TTC 染色观察脑梗死状况 电针干预结束后将大鼠称重麻醉断头取脑，将新鲜脑组织置于-20 ℃冰箱2 h 变坚硬后，放置于模具上进行切片，每个脑组织切6 片，每片厚度约0.2 cm，将脑组织切片放入2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 溶 液中，避光放入37 ℃温箱30 min，每隔5 min 翻动1次，使每个面都能均匀染色。正常组织中的脱氢酶可将TTC 还原成红色的三苯甲月替，故正常组织染色后呈红色，而缺血组织中脱氢酶活性下降，染色后呈灰白色。

1.3.3 q-PCR检测脑组织CACNα1DmRNA表达 实验结束后，取出大鼠海马，放入RNA 保存液中，-80 ℃冰箱备用。参照Trizol 一步法说明提取总RNA，具体步骤为：组织样品在液氮中研磨至粉末，立即加入1 mL Trizol，充分混匀裂解。加入200 μL 氯仿，用力充分振荡混匀，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。取上清，加入等体积氯酚仿，充分振荡混匀，4 ℃ 12 000 r/min 离心 10 min。取上清，加入等体积氯仿，充分振荡混匀，4 ℃12 000 r/min离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃沉淀 1 h。4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min。弃上清，加0.5 mL 75%乙醇，4 ℃8000~10 000 r/min离心5 min。重复上一步骤。弃上清后短暂离心，移液枪吸干乙醇，真空干燥2 min。加20 μL RNAFree water，室温溶解5 min，混匀后短暂离心得到RNA 溶液。使用Fast Quantity RT Kit 逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，放入-80 ℃冰箱保存。引物序列见表1。q-PCR 反应体系：反应总体积10 μL，其中上下游引物各 0.3 μL，cDNA 2 μL，q-PCR master Mix 5 μL，ddH2O 2.4 μL。反应条件：95 ℃预变性90 s；95 ℃变性 5 s；60 ℃复性 15 s；72 ℃延伸20 s，共计40 个循环。每个标本均设复孔，重复3 次，获得 CACNα1D mRNA 基 因 Ct 值 ，以GAPDH 为内参，按照 2-△△Ct方法处理数据。其中，△Ct=（目的基因平均 Ct-内参平均 Ct）；△△Ct=（待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct），所有数据均与内参比较。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

数据以均值±标准差（x±s）表达，采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，不符合正态分布使用秩和检验，符合正态分布采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD 检验，方差不齐使用Games Howen 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分

造模24 h 后，电针组和模型组神经功能缺损评分均高于假手术组（P＜0.05），电针组和模型组之间比较差异无统计学意义。术后7 d，电针组神经功能缺损评分低于模型组（P＜0.05），模型组神经功能缺损评分高于假手术组（P＜0.05），但电针组和假手术组比较差异无统计学意义。结果见表2。

表2 3 组大鼠神经功能缺损评分比较 （分，x±s）

2.2 脑梗死面积观察

假手术组脑切片基本呈现鲜红色，模型组可见大面积灰白色梗死灶，电针组梗死灶面积明显小于模型组。结果见图1。

图1 3 组大鼠脑梗死面积观察

2.3 CACNα1D 在海马中的表达

与假手术组比较，模型组CACNα1D mRNA表达量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，电针组CACNα1D mRNA 表达量明显降低 P＜0.01），差异有统计学意义。结果见表3、图2。

表3 3 组大鼠海马中CACNα1D mRNA 的表达 （x±s）

图2 3 组大鼠海马中CACNα1D mRNA 的表达

3 讨 论

既往研究表明，电针神庭、百会穴能够有效改善 MCAO 大鼠的神经功能状况［6］。神庭、百会穴位于督脉上，与脑关系密切，《灵枢》中有督脉“入络脑”的记载，另外，督脉为“阳脉之海”，人体阳气足则气化功能旺盛，生成气血津液，使清阳得到充养，也能使气血运行正常，经脉通畅，故历代医家有“病变在脑，首取督脉”的说法。根据现代研究表明，百会、神庭穴恰好位于与人的高级思维、记忆、精神密切相关的额、顶叶的投射区，针刺可引起神经和骨膜效应，影响和改善脑功能［7］。

钙离子通过膜上钙离子通透性通道，引起细胞内外离子电位的不同，从而引起各种活动。钙离子通道广泛存在于人体中，神经元细胞中通过电压依赖性钙离子通道内流的钙离子是动作电位诱导的神经递质释放的关键［8］，CACNα1E 被证实能够减少胰岛素的分泌，增加患2 型糖尿病的风险［9］，CACNα1A 中的新型S218L 突变与家族性偏瘫偏头痛和轻度头部外伤后延迟的致命性脑水肿和昏迷有关［10］。L 型钙离子通道为高电压激活通道，是由 α1S、α1C、α1D、α1F 几个亚基特异形成的，其中 α1D 主要分布在大脑、心脏和内分泌组织［11］，在中枢神经系统的基因表达中发挥重要作用［12］。Veng LM 等［13］通过对比观察年轻大鼠和老年大鼠的海马发现，老年大鼠CACNα1D mRNA 的表达选择性升高，这可能与CACNα1D mRNA 的表达上升后，通过L 型钙通道内流的钙离子过多有关，而过量流入的钙离子对记忆形成有害，因此推测L 型钙离子通道的电流在与年龄有关的记忆衰退中起重要作用。Xu Jiehua 等［14］通过对大鼠脑组织进行双标记荧光染色后发现CACNα1D与钙结合蛋白在大脑中不同位置的协同定位表明其对神经可塑性发挥重要作用并且两者在脊髓背角II 层的共定位比例较高，说明伤害性传递的调节机制可能与L 型钙离子通道和钙结合蛋白有关。

在本研究中，模型组和电针组大鼠CACNα1D mRNA 表达量均高于假手术组，经过电针干预后，电针组大鼠海马中CACNα1D mRNA 表达较模型组明显下降（P＜0.01），推测可能由于电针干预后抑制了CACNα1D mRNA 的表达，减少了钙离子的流入，进而影响动作电位的生成，以及后续神经递质的释放。但由于脑卒中病理机制的复杂性和电针干预效果的多靶点特征，对于电针改善脑卒中症状的机制还有待进一步研究。