枸橼酸爱地那非人肝微粒体代谢产物鉴定及性别差异*

赵晓悦，宋俊科，杜冠华

(北京协和医学院&中国医学科学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050)

磷酸二酯酶是有多种亚型的一类以磷酸酯为底物的水解酶，Ⅴ型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5，PDE5)主要分布于阴茎海绵体、肺、大脑、血管平滑肌细胞，血小板以及心肌细胞，可特异性水解环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate， cGMP)，从而调节阴茎和肺等器官或组织中血管平滑肌收缩力，参与血小板聚集过程，影响脑内cGMP信号传导途径[1]。2005年，美国食品药品管理局(FDA)批准PDE5选择性抑制药西地那非用于治疗肺动脉高压，缓解患者呼吸困难等症状[2]。PDE5选择性抑制药对于心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病的治疗和预防作用也受到越来越多的研究和关注。

枸橼酸爱地那非是我国自主研发的一种高效PDE5选择性抑制药，属于化学药品第 1.1类新药[3]。与同类药物分子相比，爱地那非分子对PDE5的特异性结合力强，结构共平面性好，酯水分配比合理，有利于药物吸收和分布[4]。由于爱地那非前期开发主要针对男性勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)的临床治疗，其临床前研究全部使用雄性动物，临床试验受试者也均为男性[5-10]。因此，探究性别差异对爱地那非代谢的影响，对于爱地那非药理学应用的开发和研究十分必要。

笔者在本研究建立不同性别来源人肝微粒体体外代谢孵育体系模型，通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，鉴定爱地那非代谢产物，探究不同性别人肝微粒体代谢差异，以期为扩大临床应用范围提供实验依据。

从学生的举例中选择一个命题，做为课堂研究的对象.如在本节课中，有同学举例“若2b=a+c，则a,b,c成等差数列”，以下讨论便围绕此命题展开.

在钻进机构抵达限幅机构预定位置时，对接锁合组件能够实现限幅机构与钻进机构的锁定，从而使得限幅机构与钻进机构进行随动，保证后续的钻取采样作业顺利进行。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 人肝S9，混合人源肝微粒体，男性肝微粒体，女性肝微粒体[购买自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，批号：X008023(人肝S9)，X038076(混合人源肝微粒体)，MX008064(男性肝微粒体)，FX008064(女性肝微粒体)]；枸橼酸爱地那非原料药(悦康药业集团股份有限公司，批号：019141102，)；其他试剂与溶剂均为市售分析纯。

1.2仪器 Waters CQUITY UPLC液相色谱系统，Waters Xevo G2 QTof质谱仪，Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，USA)；高速冷冻离心机(美国Beckman)；Eppendorf移液器(德国Eppendorf)；Eppendorf离心机(德国Eppendorf)。

1.4人肝微粒体孵育体系 孵育体系终体积1 mL，其中人肝S9或微粒体蛋白质浓度1 g·L-1，爱地那非浓度100 μg·mL-1，以三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH值=7.4)补齐体积。37 ℃预孵5 min，加入终浓度1 mmol·L-1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide ademine dinucleotide phosphate，NADPH)辅酶溶液启动反应。37 ℃恒温孵育 8 h。到达终点后加入5倍体积(5 mL)冰乙腈终止反应，振荡3 min，高速离心10 min，吸取上清液吹干。复溶后振荡离心，取上清液进样。对照组不加爱地那非，以Tris-HCl缓冲液代替，其余同上述处理过程。

M4为爱地那非的N-N'脱烷基产物。M4的准分子离子峰m/z 449.1966比原准分子离子低40.0313 Da，元素组成为C20H28N6O4S，表明原分子丢失了C3H4结构。M4的二级质谱中存在碎片离子m/z 377.1311，312.1694，和284.1315，而不存在m/z 113.1099和99.0924，表明哌嗪环结构破坏(N，N'-脱异丙基)。

1.5代谢产物的检测和鉴定 ①数据库的建立。使用ChemDraw软件绘制爱地那非化合物结构式，连同微粒体代谢可能发生的所有反应类型(包括Ⅰ相反应和Ⅱ相反应)等相关信息一起导入沃特世UNIFI 科学信息系统平台系统，形成数据库；②获得初步鉴定结果。由UNIFI软件根据导入的信息自动鉴定识别可能的代谢产物，并设置过滤器参数对识别结果进行初步筛选，过滤掉响应值<2000、精确质量数误差>10×10-6的化合物，得到初步的化合物鉴定结果；③人工识别和鉴定。参考已有文献报道，结合爱地那非质谱特征、相对保留时间、精确分子质量、分子式和多级质谱碎片等信息，对初步鉴定结果进行验证核查，得到最终代谢产物鉴定结果。

1.3分析条件 色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.4%甲酸溶液；洗脱程序：0～2 min(10% A)，>2～47 min(10%→100% A) ，>47～52 min (100% A)，>52～55 min(100%→10% A)， >55～60 min (10% A)；流速0.3 mL·min-1；进样量为5 μL。

由于目前的企业大多属于经营权和所属权背离，所以公司的董事会与监理会需要展现其应该具备的功能，对管理阶层开展的工作实施监管，严谨预防管理阶层造假，蒙蔽审计者，导致企业在信誉层面出现亏空，同时给公司长久的发展收益带来影响。另外作为企业的董事层，需要多加入企业的人才挑选与培养，重视公司财务近期的情况的时候，针对财务部门用人机制需要严格把控，严谨防止一人多岗，岗位不划分的状况出现。

2 结果

M3为爱地那非中的N-S键断裂并引入羟基的产物。M3的准分子离子峰m/z 393.1227，比原准分子离子低96.1052 Da，元素组成为C17H20N4O5S，且不存在碎片离子m/z 113.1099和99.0924，表明哌嗪环丢失，吡唑吡啶结构中引入一个羟基。M3的碎片离子m/z 365.1019元素组成为C15H17N4O5S，表明苯环上C-O键断裂，丢失C2H4结构。 碎片离子m/z 312.1657和284.1348与原分子相同，表明羟基在C-S键断裂后裂解，推测羟基被引入到与C-S键相邻的碳中。

2.2爱地那非代谢产物的LC-MS表征及性别代谢比较 在NADPH存在的体外人肝微粒体孵育体系中，爱地那非产生了多个代谢产物。图2显示了爱地那非在人肝S9、混合人源肝微粒体、男性肝微粒体、女性肝微粒体孵育体系中代谢8 h得到的代谢产物总离子色谱图。由表1可知，混合人源肝微粒体、男性肝微粒体和女性肝微粒体中均检测到了全部8种代谢产物；人肝S9中检测到除M5和M7以外6种代谢产物。表1详细总结了爱地那非及其8种代谢产物的化学式、准确质量、保留时间、碎片离子信等详细色谱和质谱信息。8种代谢产物的推测结构和代谢过程如图3所示。

图1 爱地那非的MS/MS谱图及可能的质谱裂解途径

2.3爱地那非代谢产物的LC-MS鉴别 M1和M2 为爱地那非的羟基化产物。M1和M2的准分子离子峰m/z 505.2228比原准分子离子高15.9949 Da，分子式为C23H32N6O5S，表明原分子中引入了一个氧原子。M1的二级质谱解析中包括碎片离子m/z 487.2310(C23H31N6O4S，-H2O)，375.1121，310.1525，282.1216，113.1055，99.0945。其中m/z 375.1121(C17H19N4O4S)，310.1525(C17H17N4O2)，282.1216(C15H13N4O2)比原分子的离子碎片m/z 377.1311(C17H21N4O4S)，312.1585(C17H19N4O2)，284.1281(C15H15N4O2)低2 Da(-2H)，表明羟基的引入位置是吡唑吡啶结构中的丙基侧链。碎片离子m/z 113.1055，99.0945与原分子相同，表明M1中哌嗪结构完整。而与M1不同的是，M2中碎片离子m/z 377.1272，312.1657，284.1281与原分子相同，而m/z 111.0959(C6H11N2)比原分子的碎片离子m/z 113.1099(C6H13N2)低2 Da，表明M2的羟基化发生在哌嗪结构中。

A.人肝S9代谢；B.混合人源肝微粒体代谢；C.男性肝微粒体代谢；D.女性肝微粒体代谢。

图3 爱地那非在体外人肝微粒体中的代谢途径

表1 爱地那非及其在人肝微粒体中代谢产物的质谱表征

2.1爱地那非的液相色谱-质谱(LC-MS)表征 采用LC-MS方法检测爱地那非色谱和质谱裂解行为。保留时间13.6 min，准分子离子峰[M + H]+为m/z 489.227 9，分子式为C23H32N6O4S，见图1。爱地那非产生的二级碎片离子有m/z 377.1311，312.1585，284.1281，113.1099和99.0924。爱地那非分子失去哌嗪结构(m/z 113.1099)形成碎片离子m/z 377.1311，而后通过C-S键裂解形成碎片离子m/z 312.1585，C-O键断裂又进一步形成碎片离子m/z 284.1281。碎片离子m/z 113.1099失去烷基产生m/z 99.0924。这些碎片离子信息可用于后续代谢产物的鉴定和分析。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流速600 L·h-1，锥孔气体流速50 L·h-1，锥孔电压30 V，毛细管电压3 kV，质量扫描范围m/z 50～1200。使用MassLynx V4.1进行数据采集与分析。

M5为M4脱氨基并发生羟基化的产物。M5的准分子离子峰m/z 448.1649比M4的准分子离子低1.0371 Da，元素组成为C20H25N5O5S，表明在M4分子基础上发生脱氨基变化的同时又引入一个羟基。通过碎片离子m/z 377.1311，311.1547，283.1222的存在推定羟基的引入位置在破坏后的哌嗪结构中。

M6是爱地那非的羟基化和去甲基产物。M6的准分子离子峰m/z 491.2071比原准分子离子高1.9792 Da，元素组成为C22H30N6O5S，表明丢失甲基(-CH2)并引入氧原子。M6的二级质谱中存在碎片离子m/z 377.1272，311.1511和284.1349，而不存在m/z 113.1099和99.0924，表明在哌嗪结构中发生了羟基化和甲基丢失。

M8为M7的脱氢产物。M8的准分子离子峰m/z 501.1915比M7的准分子离子低2.0156 Da，元素组成为C23H28N6O5S，表明在结构上失去两个氢原子。M8的二级质谱结构与M7相比缺少碎片离子m/z 111.0916，说明失去的氢原子来源于哌嗪结构，脱氢变化后哌嗪结构被破坏。

M7为爱地那非的羟基化和脱氢产物。M7的准分子离子峰m/z 503.2071比原准分子离子高13.9792 Da，元素组成为C23H30N6O5S，表明结构上引入一个羟基并脱去两个氢原子。M7的碎片离子m/z 111.0916比原分子的碎片离子m/z 113.1070(C6H13N2)低2.0154 Da，其他碎片离子m/z 377.1351，311.1582和284.1349与原分子相同，表明在哌嗪结构上发生脱氢变化并引入了氧原子

式中,k(·,·)θc是关于参数θc的协方差函数。一般而言,协方差函数决定了分布的平滑程度。各向同性均方指数核函数是经常使用的协方差函数形式,其解析形式如下:

高校图书馆的特色资源是高校资源的优势所在，越来越凸显其不可替代的核心作用，并俨然成为图书馆核心竞争力的重要指标。特色资源为教学科研以及专业人才培养提供了有力的资源保障。

由表3可知，在该实验条件下加标回收率范围为99%～102%，相对误差范围为±2%，得到的的实验结果准确度较高。

3 讨论

研究表明，西地那非在小鼠体内的的免疫调节作用存在药动学和药效学相关的性别依赖性差异[11]。因此，在爱地那非的开发过程中，性别差异性研究十分重要。

本研究采用UPLC-Q-TOF MS法，最终共鉴定代谢产物8种，均为水溶性，无明显毒性结构的Ⅰ相代谢产物。其中M7(羟基化并脱二氢产物)和M8(M7进一步脱氢产物)为首次报道的代谢产物。

3种不同性别人肝微粒体孵育体系检测到的代谢产物种类一致，表明爱地那非在不同性别人群肝脏微粒体代谢过程中不存在代谢产物差异。由此推测，不同性别的人群对爱地那非的肝脏代谢过程一致，女性患者在服药过程中，不会因肝微粒体代谢过程而增加未知副作用。人肝S9样品中发现6种代谢产物，多为相对含量较高的代谢产物，推测这与人肝S9中酶成分较肝微粒体更为复杂，酶含量相对较低有关。

开展爱地那非的药物代谢性别差异研究，可以帮助阐明药物的毒副作用，对于药动学、药效学和药物的安全性评价等研究具有重要意义，为新适应证的开发提供了数据支持，同时为体外实验的结果外推至体内试验提供了理论支持。