十一酸睾酮原位凝胶植入剂避孕效果及对雄性大鼠生殖系统的影响*

张晓伟，金瑛，易东旭，杨立群，张翀，刘丹华，孟胜男

(1.中国医科大学药学院药剂教研室，沈阳 110122；2.辽宁省计划生育科学研究院，沈阳 110031；3.国家卫健委生殖健康与遗传医学重点实验室，沈阳 110031)

男性激素避孕是一种非常有潜力的避孕手段，目前已经有大量临床试验证明了其安全性和有效性[1-2]。但是药物制剂释放速度不平稳导致体内激素水平急剧变化带来的不良反应，如情绪变化、痤疮、性功能障碍等，降低了人们对这种避孕方法的接受度，也成为男性激素避孕手段继续发展的瓶颈[3]。因此，对该类激素相关药物的剂型加以改善，降低激素相关不良反应发生率，不仅有助于男性激素避孕手段的继续发展，也有助于改进激素补充疗法等相关药物平台。植入剂是避孕领域最常见的药物缓释剂型，但传统植入剂制备工艺复杂，成本高昂，需要在局部麻醉下进行外科切口后埋植。如果植入剂为生物不可降解型物质，还需额外手术进行清除，使用极为不便，患者顺应性差[4-5]。

溶剂沉淀型原位凝胶植入剂(solvent-removal precipitation based in situ forming implant，SRP-ISFI)是将高分子聚合物与药物一同溶解或溶胀于可与水互溶的适宜有机溶剂中所得可注射制剂[6]。局部注射后，SRP-ISFI中有机溶剂与生理环境中的水相互交换，聚合物沉淀凝固形成半固体或固体药物缓释贮库。目前，SRP-ISFI已经有多种制剂被美国食品药品管理局(FDA)批准上市，包括Atridox®、Eligard®等[7-9]。SRP-ISFI克服了传统植入剂缺点，具有可用于病变部位局部给药、延长释药周期、降低给药剂量和药物不良反应、避免植入剂手术植入的痛苦、患者顺应性好、制备工艺相对简单等优点。

笔者之前采用聚己内酯丙交酯制备十一酸睾酮原位凝胶植入剂(testosterone ondecanoate-loaded injectable in situ forming implants，TU-ISFI)，并对该制剂工艺和药物体外释放机制等进行初步考察，TU-ISFI可以在体外稳定释放药物长达3个月[10]。笔者在本实验观察该药在大鼠体内避孕效果及可逆性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 十一酸睾酮(testosterone undecanoate，TU，纯度：98%，购自武汉远成药业有限责任公司)；TU注射液(浙江仙居制药股份有限公司生产，批号：180601)；TU-ISFI(本实验室自行制备[10])。聚己内酯丙交酯[poly (DL-lactide-ε-caprolactone)，PLCA，购自山东岱刚生物技术有限公司，批号：20171110]。其他试剂均为分析纯。

8周龄Sprague-Dawley大鼠，雄性体质量200～220 g，雌性体质量180～200 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽) 2010-0001。本实验涉及的动物实验研究内容，严格按照中国医科大学实验伦理学相关政策文件规定要求执行。

1.2TU-ISFI的制备 按20%浓度比例称取适量PLCA溶于N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone，NMP)，37 ℃搅拌保存过夜，直至得到透明澄清PLCA溶液。将该溶液在65 ℃加热，除去其中所溶解气体。分批称取适量过筛孔内径0.148 mm筛(100目)TU药粉，分散在PLCA/NMP溶液，搅拌至完全溶解，使最终所得TU-ISFI载药量16%。

1.3大鼠血药浓度测定 将雄性大鼠按体质量随机分为给药组和空白对照组，每组40只，给药组给予TU-ISFI，空白对照组给予不含药物的同基质同处方原位凝胶注射植入剂。将大鼠麻醉，以20-21号针头背部皮下注射。注射前后称重，精密确定给药剂量。分别于给药后适当时间点随机取大鼠5只，尾静脉取血约0.7 mL。取血后处死大鼠，取出剩余埋植剂，去除包裹组织，蒸馏水洗涤，冻干，甲醇复溶，浸泡，超声处理2 h，过滤，高效液相色谱(HPLC)法测定埋植剂中残余TU量(LA-30A，Shimadzu，日本)。血样经3500 r·min-1离心10 min(r=10 cm)得血浆，-20 ℃冷冻保存。电子发光法测定其中睾酮含量(cobas e 411，Roche，德国)。

1.4药效学动物分组 将雄性大鼠随机分为TU-ISFI大、中、小剂量组和十一酸睾酮注射液组(阳性对照组)、空白对照组，每组30只。TU-ISFI大、中、小剂量组分别注射TU-ISFI 600，300，150 mg(相当于TU 3.0，1.5和0.75 mg·kg-1·d-1)，空白对照组给予空白原位凝胶植入剂0.3 g，阳性对照组按1.5 mg·kg-1·d-1剂量按月给药，共注射3次。给药后1，3，4个月(因TU-ISFI可持续释放3个月，给药后4个月相当于停药1个月)，每组取10只进行生育力实验。

1.5生育力实验 交配生育实验：取各组雄性大鼠与12周龄雌性大鼠，按♂：♀=1：2合笼。合笼后每天10：00之前检测雌性大鼠阴道涂片，阴道涂片内出现精子或阴栓时，算一次交配行为。记录交配情况，将交配过的雌性大鼠编号取出，18 d后处死，记录子宫内存活胎仔及死胎数。检测交配行为共进行6 d，6 d后未发现交配行为的雌鼠，也在18 d后处死，观察怀孕情况。实验结束计算怀孕率、平均胎仔数、死胎率。

1.5.1生殖系统发育 雄性大鼠配对结束后称重，脱臼处死，解剖，记录睾丸、附睾和精囊质量，计算生殖器相对质量。生殖器相对质量=器官质量/体质量×100。

1.5.2睾丸组织细胞形态学 取新鲜分离的大鼠睾丸组织，Bouin’s固定液固定至少24 h。常规上行梯度乙醇脱水、石蜡包埋，切取厚度5 μm组织切片。常规苏木精-伊红(HE)染色，观察睾丸内细胞形态和精子发生状况。

1.5.3精子计数和精子活动力测定 另取两侧附睾尾组织各约100 mg，剪碎置15 mL任氏液，37 ℃孵育10 min，使精子在培养液内分散均匀。取一滴精子悬液滴在血细胞计数板上，按照血细胞计数法测定精子密度，并分别计算活动精子数和不活动精子数，换算成精子活动力百分比和每个附睾中精子总数。

1.5.4精子形态 取上述精子悬液30 μL滴在载玻片上，盖玻片与载玻片呈45度角迅速推膜，制成精液涂片，水平放置10 min，晾干。晾干后浸入95%乙醇与甲醇混合液中固定2～3 min，取出后再次晾干。常规HE染色，磷酸盐缓冲液冲洗调色，高倍显微镜下观察精子形态。

1.6统计学方法 采用SPSS 19.0版软件对实验数据进行统计分析，计数资料采用卡方检验，计量资料采用单因素方差分析法和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠体内释放情况 TU-ISFI在血浆中的睾酮浓度-时间曲线见图1。植入后，给药组血浆睾酮浓度迅速超过空白对照组，7 d后给药组血浆睾酮水平开始急剧上升，28 d达到最大值，然后开始缓慢下降，90 d血浆睾酮浓度与空白对照组持平。实验结果提示TU-ISFI可在3个月内持续维持大鼠体内较高血浆睾酮浓度，3个月后大鼠体内睾酮水平回落至正常。植入剂残余药量测定结果表明，TU-ISFI在大鼠体内药物突释量较小，第7天共释放约14.7%药物，第28天共释放约47.3%，第63天累积释放量达到89.9%，第90天时基本全部释放。

图1 两组大鼠血浆睾酮浓度变化

2.2交配生育实验结果 结果见表1。给药1个月后，TU-ISFI大、中、小剂量组和阳性对照组怀孕率和平均胎仔数均较空白对照组高，此时外源性睾酮已经开始抑制新的精子产生，但由于大鼠精子整个发生时程为48 d，睾酮主要在精子产生初期发生作用，因此1个月时还不能达到避孕效果。大鼠精子发生周期时程为12 d，整个精子发生时程为48 d，给药1个月，因为睾丸内睾酮水平下降，导致减数分裂期和精子形成期生精细胞大量丢失，但对已经成熟或者接近成熟的精子不起抑制作用，因此不能达到完全避孕效果。给药3个月后，TU-ISFI大、中剂量组可达到100%成功避孕；TU-ISFI小剂量组避孕成功率75%，怀孕胎仔数明显下降；阳性对照组避孕成功率90%，10只雄鼠中有1只雄鼠的两只配对雌鼠怀孕，未达到100%避孕效果。停药1个月后，TU-ISFI大、中、小剂量组繁殖能力开始恢复，阳性对照组繁殖能力仍受到抑制。

表1 大鼠交配生育实验的结果

2.3生殖系统发育分析 结果见图2。给药后1个月，与空白对照组比较，TU-ISFI大、中、小剂量组生殖器整体相对质量增加，睾丸质量减轻，精囊增大，附睾无明显变化；阳性对照组生殖系统整体质量下降，睾丸、附睾均缩小，精囊稍增大。给药后3个月，与空白对照组比较，其他各组生殖系统整体质量较低，主要由于睾丸和附睾萎缩，其中TU-ISFI大、中、小剂量组睾丸质量约为空白对照组的50%，阳性对照组睾丸质量为空白对照组的三分之一。停药后1个月，TU-ISFI大、中、小剂量组睾丸和附睾大小恢复较快，阳性对照组生殖系统恢复较慢。

2.4睾丸组织细胞形态学检测 结果见图3。给药后1个月，TU-ISFI各剂量组睾丸曲细精管内各级精母细胞、精子细胞、精子及间质细胞均清晰可辨，未见明显形态学变化；阳性对照组部分曲细精管内生殖细胞蜕变，坏死脱落。给药后3个月，TU-ISFI大剂量组和阳性对照组大部分曲细精管内生殖细胞明显减少，排列疏松，层次变薄，腔缘不整齐；精子、精子细胞及精母细胞部分蜕变，脱落；部分区域管腔皱缩，细胞稀少，腔内空虚，近基底膜仅见少许散在精原细胞、精母细胞或支持细胞，部分仅衬覆几个精原细胞，管腔内明显可见多个多核巨细胞。TU-ISFI中、小剂量组可见局部曲细精管内生殖细胞减少，排列疏松，层次变薄，细胞稀少，部分腔内空虚，近基底膜仅见少许散在的精原细胞，支持细胞或蜕化中的精母细胞亦见多核巨细胞。与TU-ISFI大剂量组比较，TU-ISFI中、小剂量组形态学变化及范围具有明显剂量依赖性。

图2 TU-ISFI对大鼠体质量和生殖系统发育的影响

停药后1个月，阳性对照组大部分曲细精管仍皱缩，生殖细胞明显较少，排列疏松，层次变薄，细胞稀少，腔内空虚，近基底膜仅见少许精原细胞、精母细胞及支持细胞，小部分曲细精管内生精细胞清晰可见，仍见精子发生。TU-ISFI大、中、小剂量组可见部分区域曲细精管内生殖细胞减少，排列疏松，层次变薄。局部曲细精管内生殖细胞蜕变，坏死，脱落，腔内空虚，但大部分曲细精管内各级精母细胞、精子细胞及正常精子均清晰可辨，间质未见明显形态学变化，其形态学变化及范围具有明显剂量依赖性。

2.5精子计数和精子活动力 结果见表2。给药后1个月，与空白对照组比较，其他各组精子数量明显下降，下降程度依次为：阳性对照组>TU-ISFI大剂量组>TU-ISFI中剂量组>TU-ISFI小剂量组，可能由于外源性睾酮作用，TU-ISFI大、中、小剂量组精子活力与空白对照组相比显著提高。给药3个月后，除空白对照组外，其他各组精子数均极少，TU-ISFI大、中剂量组精子活动力为0，TU-ISFI小剂量组和阳性对照组精子活动能力底下。停药1个月后，TU-ISFI大、中、小剂量组精子数有所恢复，精子活动率回升至20%以上，阳性对照组仍处于被抑制状态。

图3 5组睾丸组织形态学变化(St.睾丸精子细胞；Sc.精母细胞；Sg.精原细胞；G.多核巨细胞；*.曲细精管空腔；×400)

2.6精子形态 给药1个月时，TU-ISFI中、小剂量组精子形态未见明显异常；TU-ISFI大剂量组可见个别异常形态精子，主要表现为尾部折叠、头部无钩等；阳性对照组可见大量异常形态精子，主要表现为无定形、胖头等。给药3个月，阳性对照组出现大量精母细胞，精子细胞及精子蜕变、坏死，大量精子出现无头、断尾等畸形表现；TU-ISFI大、中、小剂量组出现大量精母细胞、精子细胞及精子蜕变、坏死，精子形态学变化均与阳性对照组相近，程度略低。

停药1个月后，TU-ISFI大、中、小剂量组仍可见单个精母细胞及精子细胞蜕变、坏死，精子形态大部分完好，畸形率较低，形态学变化与给药1个月时相近；阳性对照组可见部分蜕变坏死精母细胞、精子细胞及精子，部分精子畸形，主要是无钩、胖头、断尾等。

3 讨论

我国曾开展过TU注射液用于男性激素避孕的临床多中心研究，该研究中，TU在男性避孕方面的有效性得到肯定，但在不良反应发生率以及安全性方面存有质疑。此外，部分受试者希望能够有更长效的TU制剂[11]。

表2 5组不同时间附睾精子数和精子活动率

图4 5组精子形态变化(Sp.精子；WBC.白细胞；ab-SP.畸形精子；d-Sc.退变坏死的精母细胞；×400)

本研究结果表明，给药1个月后，TU-ISFI各剂量组精子数有所下降，但精子活动力上升，因此母鼠妊娠率较空白对照组高。大鼠精子发生周期时程为12 d，整个精子发生时程为48 d，给药1个月时，因为睾丸内睾酮水平下降，导致减数分裂期和精子形成期生精细胞大量丢失，但对已经成熟或者接近成熟的部分精子起不到抑制作用，因此不能达到完全避孕效果。给药3个月后，各剂量组均达到抑制精子发生效果，在避孕效果上，TU-ISFI大、中剂量组优于阳性对照组，避孕率达到100%。实验发现，给予大鼠小剂量TU并不能对睾丸本身合成和分泌睾酮的功能实现完全干扰，仍有极少部分有活力精子产生，导致避孕失败。从停药1个月后恢复情况看，由于后期TU-ISFI释放药物量逐渐降低，避免了阳性对照组每个月一次给药带来的波谷现象，有利于停药后精子数目和精子活力恢复。

综上所述，TU-ISFI以300～600 mg剂量(即1.5～3.0 mg·kg-1·d-1剂量TU)对大鼠给药后可达到优于阳性对照组的避孕效果，停药后大鼠生殖能力可迅速恢复。后续研究中，笔者还将考察其安全性和不良反应发生情况，对其剂量进一步筛选。从目前研究来看，TU-ISFI具有平稳药物缓控释能力，对雄性大鼠避孕效果优良，作用更为温和并且可靠，是一种具有广阔应用前景的激素补充制剂和男性避孕制剂。