超高效液相色谱法测定葛根提取液中葛根素的含量

刘 露，刘飞翔，丁 斌，蒲顺昌，方颂平， 吴文睿，邢 爽，董 琪，刘开放

(亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800)

葛根，是药、食两用的天然植物资源，为豆科植物野葛的干燥根，习称野葛。具有重要的药理作用和丰富的营养元素，因此，葛根被看成一种药食两用植物。在祟尚“回归自然”和“药食同源”等保健理论，使得葛根的开发利用具有重要的现实和经济意义。葛根素是从豆科植物野葛根中提取的一种单一成份黄酮苷，呈白色针状结晶体，易溶于甲醇、乙醇，能溶于水，是从中药葛根中分离的具有扩冠作用的异黄酮类衍生物[1-2]，具有生津止渴、活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用，其制剂葛根素注射剂临床用于治疗心脑血管疾病及视网膜血管病、眼底病及突发性耳聋等[3-4]。由于葛根素的以上功效，使得葛根素得到了广泛的应用，例如葛根素配制酒的研发，葛根茶饮品以及葛根粉等[5-7]。葛根素是葛根中的黄酮苷，将其应用到生产生活中需要将其从葛根中提取出来，因此适宜的葛根素提取及检测方法的开发，对葛根素的广泛应用具有极大的推动作用，本文主要探讨葛根素含量快速检测的方法，为其在各行业中的应用提供理论支撑。

目前检测葛根素有多种方法，主要为薄层层析法、薄层扫描法(TLCS)、紫外分光光度法和高效液相色谱法等[8-10]，其中2015版《中国药典》二部葛根素的检测为高效液相色谱法，检测时间为45 min；国标 《GB/T 22251-2008 保健食品中葛根素的测定》采用高效液相色谱法测定其葛根素的含量，检测时间为20 min。通过以上检测时间分析，葛根素的检测存在耗时久的问题，不适宜药企、保健品等一些企业的快速生产与检测，为解决葛根素检测时间耗时久的问题，本实验在参考药典和国标方法的基础上，对检测条件进行优化，采用超高效液相色谱法(二极管阵列检测器)，测定葛根提取液中葛根素的含量，最终检测时间比中国药典部中的HPLC法省时40 min，且灵敏度高，准确性好，是一种适用于葛根提取液中葛根素简便、快速、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 超高效液相色谱仪Acquity UPLC(美国 Waters公司);二极管阵列检测器(PDA，美国Waters公司);Empower 色谱工作站；涡旋振荡仪(thermo)；0.22 μm针式过滤器(天津津腾)；电子天平(梅特勒公司)；实验室用水为Milli-Q超纯水(美国 Millipore公司)。

1.1.2 试剂与标准品 葛根素(含量≥99%，ANPEL)，甲醇(HPLC，CNW)。

1.1.3 样品 葛根购于康美中药材交易中心，用粉碎机粉碎后，用密封袋包装备用。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根提取液的制备 取2.0 g 的葛根粉，加入50%乙醇16 mL，在60 ℃恒温水浴下用索氏提取器回流提取 40 min，所得溶液用旋转蒸发仪除去溶剂后用 70% 甲醇稀释定容至20 mL。

1.2.2 标准溶液的配制 准确称取0.0200 g葛根素标准品，用70%甲醇溶解并定容至10 mL，混匀待用。

1.2.3 葛根素标准使用液的配制 准确吸取1.00 mL葛根素标准储备溶液于10 mL 容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，混匀待用。

1.2.4 葛根素标准溶液的配制 分别吸取标准使用液，用70%甲醇稀释并定容至浓度分别为5、10、20、40、50、100 mg/L的标准系列。

1.2.5 样品前处理 吸取1.2.1方法制备的葛根提取液，用0.22 μm针式过滤器过滤至进样瓶中，待上机检测。

1.2.6 色谱条件 流动相：甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1作为流动相；色谱柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流速：0.6 mL/min等梯度洗脱；检测波长：247 nm；进样体积：1 μL；采样速率：20 点/s。

1.2.7 色谱分析 在上述条件下，对标准溶液系列和样品净化液进样进行液相色谱分析，以保留时间定性，以峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

本实验流动相验证了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-乙酸等流动相在不同流速下对色谱分离效果和葛根素保留时间的影响，结果表明，甲醇-水分离效果好并且保留时间短。 甲醇-水中甲醇的比例越大,物质出峰时间越早。 综合考虑，当甲醇-水比例为 25∶75 时，样品分离效果好，峰面积值最大。流动相为甲醇+水+乙酸=25∶74∶1峰型相比于甲醇-水比例为 25∶75更好，所以选用甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1作为流动相。在流速分别为 0.2、0.4、0.6、0.8 mL/min 的条件下，选择流动相为甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1的配比条件下测定葛根素的含量， 发现流速对葛根素的含量没有太大的影响，而对其保留时间和峰型存在一定影响，综合考虑保留时间和色谱峰峰型选择流速为0.6 mL/min。因此本实验的色谱测定条件为甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1，流速为0.6 mL/min。

2.2 谱图、精密度及加标回收率实验

2.2.1 葛根素色谱测定分析 在以上色谱条件测定葛根素标样和葛根提取液中葛根素含量，色谱检测分析结果见图1和图2。

图1 葛根素标准样品色谱图

图2 葛根素提取液中葛根素色谱图

从图1～2中可以看出，葛根素标准品及葛根提取液中葛根素保留时间一致，为0.92 min，且样品葛根提取液中葛根素和其他物质分离度较好，能够满足测量需求。

2.2.2 标准曲线建立 色谱测定条件为甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1，流速为0.6 mL/min条件下，建立的葛根素标准曲线见图3。

图3 葛根素标准曲线

葛根素标准溶液浓度在(5～100) mg/L之间，分别取浓度为为5、10、20、40、50、100 mg/L的标准储备液建立标准曲线，由图3可知在此范围内有较好的线性关系，相关系数R2=0.999，标准曲线方程为Y=9752.6X+2452。满足测定方法关于线性关系要求。

2.3 葛根提取液中葛根素含量测定精密度实验

2.3.1 方法重复性测试 用1.2.1方法制备的同一葛根提取液样品进行6次检测，其结果见表1。

表1 样品重复性测定结果

从表1可以看出葛根提取液样品中葛根素含量的重复性实验测定结果RSD为4.16%，结果较好，满足测定要求。

2.3.2 方法重现性测试 用1.2.1前处理方法分别处理的6个葛根提取液样品进行检测(表2)。

表2 样品重现性测定结果

从表2可以看出葛根提取液样品中葛根素含量的重现性实验测定结果RSD为4.93%，结果较好，满足测定要求。

2.3.3 样品加标回收率测试 对样品进行3个水平的加标回收检测，结果见表3。

表3 样品回收率测定结果

从表3可以看出加标回收率在99.38%～103.30%之间，方法回收率满足定量测定要求。

3 结论与讨论

通过考察不同种类流动相在不同流速下对色谱分离效果和葛根素保留时间的影响，发现甲醇-水分离效果好并且保留时间短。流动相中甲醇的比例越大,物质出峰时间越早。因此，当甲醇-水比例为25∶75时，流速为 0.6 mL/min 时，样品分离效果好，峰面积值最大。当把流动相调整为甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1时，峰型相比于甲醇-水比例为25∶75更好，所以选用甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1作为本实验流动相。在此条件下，为得到好的峰型，考察了流速的影响，发现当流速为0.6 mL/min时，色谱峰型最好。因此本实验的色谱测定条件为甲醇∶水∶乙酸=25∶74∶1，流速为0.6 mL/min,此时样品分离效果及峰型较好，峰面积值最大。使用超高效液相色谱法测定葛根提取液中的葛根素的含量，葛根素保留时间为0.920 min，线性关系R2=0.999，加标回收率在99.38%～103.30%之间，重复性与重现性测试结果较好，保证了仪器分析的准确性，满足定量分析要求。且样品前处理简单易操作，与药典及国标检测方法等相比较，显著节约了样品分析时间，综上所述，本方法具有简便，准确高效的特点，适用于葛根提取液中葛根素的含量测定。