银屑病皮损间充质干细胞对人角质形成细胞增殖及凋亡的影响

梁男男，常文娟，张开明

银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤疾病，主要特点为角质形成细胞的异常增殖和分化，同时伴有免疫细胞的浸润。角质形成细胞是表皮最主要细胞类型，主要通过调节自身增殖和凋亡来维持细胞稳态，当受多种因素如炎性因子、趋化因子和钙离子浓度等影响时，细胞代谢紊乱，从而导致银屑病等各种皮肤病的发生[1]。间充质干细胞是一种多潜能干细胞，不仅参与皮肤组织再生，而且还通过分泌细胞因子影响皮肤微环境。前期研究发现银屑病患者皮损的间充质干细胞（dermis mesenchymal stem cells，DMSCs）细胞因子分泌异常[2,3]，笔者推测DMSCs是否通过调节细胞因子的分泌从而影响KCs的增殖及凋亡。其中转化生长因子（TGF）-β1作为DMSCs分泌的一个重要细胞因子可以抑制角质细胞的增殖和分化[4]。本研究检测共培养后DMSCs对正常人表皮角质形成细胞（human normal keratinocytes cells，KCs）增殖及凋亡的影响，旨在分析细胞因子TGF-β1在其中的作用。

1 资料与方法

1.1 组织来源

银屑病皮损来源：选择2017年9月—2019年7月就诊于太原市中心医院皮肤科门诊并确诊为寻常性银屑病患者，男女各5例，年龄18～60岁，平均年龄36岁。就诊前3个月内未使用过糖皮质激素、维A酸及免疫抑制剂。正常皮肤组织取自我院泌尿外科及骨科手术切除皮肤，且患者无银屑病史，与患病组年龄、性别相匹配。患者均签署知情同意书，本课题经太原市中心医院医学伦理委员会批准通过。

1.2 试剂与仪器

胎牛血清和DMEM-F12（Hyclon公司），dispase酶和胰酶（Sigma公司），角质形成细胞培养基K-SFM（Gibco公司），12孔Transwell培养板（Corning公司），细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒CCK-8（武汉博士德生物工程有限公司），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。倒置显微镜（日本Olympus），流式细胞仪（BDFAC-SCalibur型），37℃恒温培养箱（Sheldon Manufacturing Inc）。

1.3 方法

1.3.1 KCs的分离与培养 无菌条件下将正常皮肤组织制备成1 mm3的组织团块，浸润于dispase酶中4℃过夜，第2天将组织进行真表皮分离，将剥离的表皮剪碎和胰酶一起转移至玻璃小瓶中，置于细胞培养箱中消化5～10 min，待组织从颗粒状变成团块状时用含10%的DMEM-F12培养基终止消化，反复吹打使细胞分离，用40 μm孔径滤网过滤，收集上清，离心后加入K-SFM培养基。细胞置于5% CO2饱和湿度培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后换液，以后每3 天全量换液1次，于倒置显微镜下观察细胞的生长状态。

1.3.2 DMSCs的分离和培养 于无菌操作台上将健康皮肤和银屑病皮损组织分别制备成1 mm3的组织团块，加入dispase酶4℃过夜，第2天机械分离真表皮，将真皮组织尽量剪碎，置于含10%FBS的DMEM-F12培养基中，用滴管反复吹打组织使细胞充分分离，随后用40 μm孔径滤网过滤，收集上清液，800 r/min，离心6 min，弃上清液，加入DMEM-F12重悬细胞。细胞置于37℃，5%CO2培养箱中孵育，待细胞贴壁后换液，以后每3 天全量换液1次。

1.3.3 分组 实验设置3个组：①KCs单纯培养组，②健康对照组（健康人DMSCs与KCs共培养组），③试验组（银屑病皮损DMSCs与KCs共培养组）。将培养至P3的DMSCs重悬，调整浓度为2×105种在Transwell板的上室，同理将KC细胞以相同浓度种在Transwell板的下室，上下室分别加入相对应的培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育96 h。

1.3.4 细胞增殖检测方法 去掉Transwell 小室，根据CCK-8检测试剂盒说明书，将共培养后的KC细胞制成细胞悬液，细胞计数后于96孔板每孔加入100 μl细胞悬液，约为1×104个细胞，每组细胞设5个复孔，同时设置空白孔（不含细胞，只有培养基）、对照孔（单独培养的细胞）和实验孔（共培养后的细胞），培养箱中孵育24 h。待检测前2 h每孔加入10 μl CCK-8溶液，于450 nm的酶标仪检测各孔A值。细胞存活率（%）=（实验组A值-空白组A值/对照组A值-空白组A值）×100%。

1.3.5 细胞凋亡检测方法 去掉Transwell 小室，用不含EDTA的胰酶消化下室KC细胞，收集1×105个细胞，用PBS洗涤细胞2次，800 r/min，离心5 min。弃去上清，加入500 μl Binding Buffer轻轻吹散细胞，避免出现细胞团块，再分别加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，混匀，室温避光反应15 min后上机检测。早期凋亡率=（凋亡细胞量/总细胞量）×100%。

1.3.6 ELISA法检测TGF-β1浓度 待细胞共培养96 h后，收集细胞上清，参照ELISA试剂盒说明书检测TGF-β1浓度。

1.4 统计学方法

所有数据均用SPSS16.0处理，定量数据采用均数±标准差（±s）表示，均数比较采用单因素方差分析或t检验。

2 结果

2.1 细胞形态

倒置相差显微镜下观察银屑病患者和健康人群分离的DMSCs，培养7 d后，细胞均呈贴壁生长，生长状态良好，两组形态无明显差异，大多呈长梭形，少数呈三角形或多边形（图1a，图1b）。KCs呈典型上皮样特征，呈铺路石样，高核质比，细胞紧密排列（图1c）。

2.2 DMSCs上清对细胞存活率的影响

图1 DMSCs 和KC在倒置相差显微镜下的形态特点（×40）

按表1设置浓度梯度，将银屑病皮损和健康人的DMSCs上清以不同比例（1:1，2.5:1, 5:1）分别加入KCs培养基中预处理，结果显示与KCs单纯培养组相比，共培养组细胞存活率普遍有所升高，且患银屑病皮损组比健康人组的细胞存活率更高（P＜0.05）；而健康人组在5:1比例时，与KCs单纯培养组相比，KCs细胞存活率无统计学差异（表1）。

表1 不同浓度DMSCs上清作用于KC后对细胞存活率的影响 （±s，n=5）

表1 不同浓度DMSCs上清作用于KC后对细胞存活率的影响 （±s，n=5）

注：与单纯培养组比较，*P＜0.05

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2.3 银屑病DMSCs对KCs存活率的影响

明确了细胞上清对KCs的促进增殖作用后，再用Transwell共培养技术进一步研究二者之间的相互作用关系，结果与KCs单纯培养组相比，健康对照和试验组细胞存活率均有所升高（P＜0.05），且试验组较健康对照组的细胞存活率更高（P＜0.05）（表2）。

表2 银屑病DMSCs对KC存活率的影响 （x¯ ±s，n=7）

2.4 银屑病DMSCs对KC凋亡的影响

用流式细胞仪检测发现，与单纯KC培养组相比，共培养组细胞凋亡率均有所升高（P＜0.05），但患病组较健康组的细胞凋亡率反而下降（P＜0.05）（表3，图2）。

表3 银屑病DMSCs对KC凋亡率的影响 （x¯ ±s，n=7）

2.5 银屑病DMSCs对细胞因子TGF-β1的影响

用ELISA检测细胞上清中TGF-β1水平，发现共培养后TGF-β1浓度下降（P＜0.05），且患病组与健康组相比降低的更明显（P＜0.05）（表4）。

图2 DMSCs作用于KC后对细胞凋亡的影响（x¯ ±s，n=6）

表4 银屑病DMSCs对TGF-β1的影响 （x¯ ±s，n=6）

3 讨论

银屑病是一种由遗传、感染、免疫等多种因素相互作用引起的一种慢性炎症性皮肤病。最常见的是寻常性银屑病，组织病理表现为角化不全或过度角化、棘层增厚、颗粒层消失[5]，说明银屑病是一种表皮过度增生的皮肤病，而KCs是组成表皮的最主要成分。正常情况下，KCs通过免疫防御、增殖分化来维持皮肤稳态，KCs从基底层逐渐向外层增殖和迁移来保护皮肤免受外界损伤和刺激[6]。银屑病患者细胞微环境发生改变，细胞因子、趋化因子和细胞内信号通路发生变化，导致细胞周期缩短[7]，所以KCs在银屑病中发挥重要作用。间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化的特点，可通过分泌细胞因子减少炎症、减少细胞凋亡。银屑病DMSCs生物学功能异常，通过分泌多种细胞因子包括趋化因子、TGF-β1、白细胞介素（IL）-22和IL-8等参与炎症反应和免疫应答[8]。其中TGF-β1是一种多功能细胞因子，不仅参与细胞分化和组织修复，研究发现TGF-β1可以通过降低c-myc水平干预细胞周期进程，从而抑制KCs的增殖和分化[9,10]；同时TGF-β1还被认为是一种抗炎细胞因子，与受体TGF-βRⅠ和Ⅱ结合，促进Smad2和Smad3磷酸化，形成复合物，易位入核调节下游靶基因[11]。

本实验采用Transwell技术，模拟DMSCs和KCs在皮肤组织中的生理环境，进一步研究二者之间的相互作用关系。首先，用不同浓度的DMSCs的培养上清来孵育KCs，结果显示与正常单纯培养组相比，不论是正常DMSCs还是银屑病DMSCs上清普遍可以显著提高KCs的细胞存活率，但二者之间没有浓度依赖性，可能是由于随着上清比例的加大，适宜KCs的培养基相对减少，导致细胞增殖反而有所下降。随后进行共培养实验，CCK-8检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡发现，试验组与KCs单纯培养组相比，细胞增殖和凋亡均有所增强；与健康对照组相比，细胞增殖加强，凋亡降低，说明银屑病皮损DMSCs可以促进KCs增殖，促进KCs凋亡能力减弱，从而导致银屑病皮损发生。为了探究其中机制，笔者检测TGF-β1，发现共培养后TGF-β1水平明显降低，进一步验证了DMSCs通过改变细胞微环境影响KCs的增殖及凋亡。

综上所述，本实验证明银屑病DMSCs可能通过改变TGF-β1分泌水平来调节KC的增殖和凋亡，从而参与银屑病的发生发展。了解DMSCs对KCs的作用机制有利于为银屑病的治疗和预防提供新的思路和靶点。