人G补缀FHA域血管生成因子1在三阴性乳腺癌的表达与预后的关系

王波 董小林

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)有效治疗方法少，易复发，预后差[1-3]。具有血管生成作用的AGGF1(angiogenic factor with G and FHA domains 1)基因在肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤中高表达，与不良预后相关[4]。本研究主要探讨AGGF1在三阴性乳腺癌中的表达情况及其与预后的关系。

对象与方法

一、对象

我院2003年1月～2009年1月我院收治的三阴性乳腺癌病人109例，均有完整病历资料及完整随访资料，排除7例Ⅳ期病人，共入选病人102例，均为女性，年龄35～71岁，中位年龄51岁。三阴性乳腺癌临床病理指标由我院病历系统获取，包括年龄、组织学分级、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、增殖指数(Ki-67)等。采用定期住院、门诊复诊或者电话随访。102例首诊并首治的三阴性乳腺癌病人，采用乳腺癌改良根治术或保乳术，化疗方案为表阿霉素+环磷酰胺4次序贯多西他赛4次或表阿霉素+环磷酰胺+多西他赛共6次，需要放疗病人化疗结束后辅以放疗，病理类型均为浸润性导管癌。病人均签署知情同意书，本研究内容经过我院伦理委员会。

二、方法

1.免疫组织化学检测：对入选的102例三阴性乳腺癌石蜡包埋组织标本进行连续5 μm切片备用。AGGF1蛋白检测一抗购于Abcam公司，检测步骤按试剂盒说明进行，用PBS代替一抗做阴性对照，用正常乳腺组织作为阴性对照。ER、PR、HER-2、Ki-67等指标检测由我院病理检测中心进行标准检测。

2.AGGF1的Western blot检测：AGGF1的蛋白提取按RIPA蛋白提取试剂盒说明进行，用BCA蛋白含量检测试剂盒进行蛋白定量检测。每孔上样40 μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜上，5%BSA室温封闭1小时，AGGF1抗体4℃孵育过夜，以β-actin抗体作为内参，实验重复3次。参照文献用Image-Pro Plus 6.0软件分析AGGF1与β-actin的灰度比值，代表AGGF1蛋白相对含量。结果判定参照同类研究文献[6]，比值<0.1为阴性表达，比值≥0.1为阳性表达，计算AGGF1蛋白表达阳性率。

三、统计学分析

应用SPSS 21.0软件分析数据。AGGF1蛋白表达与临床病理指标的关系用χ2检验，AGGF1的免疫组织化学检测结果与Western blot检测结果相关性分析采用Spearman等级相关分析,用Kaplan-Meier绘制生存曲线，行Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.AGGF1的免疫组织化学检测结果：三阴性乳腺癌组织中出现棕黄色细胞为阳性细胞，由我院2位高年资病理科医师进行阅片并结合相关文献进行结果判定[6]，随机选取4个区域，观察染色强度：无着色=0分，浅着色=1分，中等程度着色=2分，强着色=3分；观察阳性细胞所占比例：<1%=0分，1%～10%以下=1分，10%～50%=2分，>50%=3分。综合结果判定：细胞染色强度和阳性细胞所占比例得分相乘,积分<4分为AGGF1阴性表达，积分≥4分为AGGF1阳性表达。102例乳腺癌组织中，AGGF1蛋白阳性例数42例，阳性表达率41.2%，AGGF1蛋白阴性例数60例，阴性表达率58.8%，见图1。

2.AGGF1的Western blot检测结果：AGGF1蛋白Western blot检测阳性例数43例，阳性表达率为42.2%，AGGF1蛋白阴性例数59例，阴性表达率57.8%。见图2。

3.AGGF1的免疫组织化学与Western blot检测相关性：免疫组织化学检测AGGF1蛋白阳性42例，阴性60例；Western blot检测AGGF1蛋白阳性43例，阴性59例；结果显示，在三阴性乳腺癌组织中，两者检测结果一致，呈正相关(r=0.859，P=0.00)。

4.随访：102例三阴性乳腺癌病人随访时间自2003年9月～2009年1月，中位随访时间41.5个月，随访期间，死亡20例。总生存(overall-survival，OS)定

义为：接受治疗日开始至死亡的时间，随访截止仍生存为删失数据。并从住院病历系统详细记录并整理病人年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、ER、PR、HER-2、Ki-67等指标。

5.AGGF1蛋白表达与三阴性乳腺癌病人临床病理指标的关系：AGGF1蛋白表达与病人年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移间的关系无统计学意义(P>0.05)，与Ki-67间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 AGGF1蛋白表达与三阴性乳腺癌病人

6.AGGF1蛋白表达与三阴性乳腺癌病人预后的关系：AGGF1蛋白阳性表达组，随访期间死亡17例，AGGF1蛋白阴性表达组，随访期间死亡例3例。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，AGGF1蛋白阳性表达组的OS差于AGGF1蛋白阴性表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

7.以Ki-67为亚组因素分析AGGF1蛋白表达与三阴性乳腺癌病人预后的关系：Ki-67低表达63例，AGGF1蛋白阳性表达20例，阴性表达43例，随访期间死亡9例；Ki-67高表达39例，AGGF1蛋白阳性表达22例，阴性表达17例，随访期间死亡11例。以Ki-67为亚组因素，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，Ki-67高表达，AGGF1蛋白阳性表达组的OS差于AGGF1蛋白阴性表达组，差异有统计学意义(χ2=12.14,P=0.00)；Ki-67低表达，两组OS差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

讨 论

三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌比较，总体治疗效果差，生存期短，死亡率高[7-9]。积极探索三阴性乳腺癌预后相关因素，强化治疗、加强随访，从而改善预后至关重要[10]。研究发现，血管生成是恶性肿瘤发生、发展、转移的重要因素，抗血管生成的药物如贝伐单抗、索拉菲尼等已进入临床试验[11-12]。三阴性乳腺癌的治疗方法局限，相关研究发现，在三阴性乳腺癌中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)阳性表达病人易发生复发和转移，预后差[13-14]。陆颖等[15]研究发现，对于转移性三阴性乳腺癌，在化疗基础上联合血管内皮抑素可延长中位疾病进展时间。

AGGF1自发现以来，已明确其为血管生成因子[16]。有研究表明，AGGF1与肝癌病人不良预后相关，与VEGF、CD34等血管因子呈正相关[17-18]。

我们在AGGF1的免疫组织化学检测基础上，进行了Western blot检测验证，明确了两者检测结果具有高度一致性。分析显示，三阴性乳腺癌病人中，AGGF1蛋白表达阳性病人与AGGF1蛋白表达阴性病人相比，预后差，生存期短，死亡率高，差异有统计学意义。提示AGGF1蛋白阳性表达是三阴性乳腺癌预后的不良因素。此外，Ki-67在AGGF1的不同表达组间分布有差异。生存分析结果显示，在Ki-67高表达组，AGGF1蛋白表达阳性病人OS较AGGF1蛋白表达阴性病人差。

综上所述，本研究初步发现AGGF1蛋白阳性表达与三阴性乳腺癌不良预后相关，有可能可作为三阴性乳腺癌预后判断的指标。本研究后续工作探讨其与三阴性乳腺癌血管生成的关系、作用机理，以进一步明确AGGF1是否可作为三阴性乳腺癌潜在的抗血管治疗靶点，为拓展三阴性乳腺癌的治疗、改善预后提供积极的思路。