高效液相色谱法在牛乳整体蛋白检测中的应用

陈江

摘 要：蛋白质含量是牛乳及其乳制品质量评价的一项主要指标。本文对疏水相互作用色谱、反相色谱技术在牛乳整体蛋白含量测定方面的研究进展做了简要的介绍和评述，也对未来的发展提出了一些建议。

关键词：牛乳;蛋白质;高效液相色谱法

1 应用液相色谱法分离牛乳及其乳制品中的蛋白

1.1 疏水相互作用色谱（HIC）

HIC是利用盐水体系中不同蛋白的疏水残基与填料疏水性配基相互作用力的不同而进行分离的一种方法，固定相的疏水性适中。其梯度洗脱的弱洗脱剂是高浓度盐的缓冲液，而强洗脱溶液是低盐浓度的缓冲溶液，通常是在pH值为6～8条件下进行分离的。

文献[1]利用疏水色谱柱在快速蛋白液相色谱系统下，分析了β-酪蛋白、αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白与γ-酪蛋白5种酪蛋白的含量，其中γ-酪蛋白是β-酪蛋白的水解产物变种，但该方法并未分开γ-酪蛋白和αs2-酪蛋白。当调整pH值并改善缓冲液后，分离了4种乳清蛋白：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白。文献[2]用TSK疏水色谱柱对α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白进行了分析，流动相为磷酸盐缓冲液和高浓度的变性剂脲，用硫酸铵梯度洗脱，对全脂奶粉和脱脂酸奶进行了分析测定。在实际样品中分析酪蛋白主要有两个困难：酪蛋白在水中溶解度低;乳清蛋白的干扰[2]，文献[1-2]中很好的解决了这个问题，表明了TSK柱是定性定量分析实际样品很好的工具，结果准确，重现性好，在检测乳制品酪蛋白含量具有独特的优势。

1.2 反相液相色谱（RPLC）

RPLC是公认的HPLC中分离度最高，应用范围最广的液相色谱分析方法。它是基于蛋白质分子的疏水性的不同而实现分离的，与HIC相比，RPLC固定相的非极性更强。文献[3]通过实验发现对分别经盐酸胍和脲处理后的样品进行立即分析，二者具有相似的分离效果，但在放置8.5 h以后，发现用脲处理的样品的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分离度降低。同时也发现用二硫苏糖醇处理样品要比β-巰基乙醇更能改善这两种蛋白的分离效果。文献[4]又在预处理培养液中加入了Bis-tris缓冲液，离心去脂后得到了澄清溶液，用碳18反相柱分析了αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白6种蛋白。文献[5]中第一次实现对大豆蛋白和动物乳清蛋白之间的相互分离，为乳中掺假廉价植物蛋白的检测提供了参考依据。王娟[6]用安捷伦C8色谱柱分析了牛奶中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、乳清蛋白和免疫球蛋白，线性关系良好，相关系数均大于0.999，用外标法测定回收率在75%～132%。RPLC法的优点是分离度高，与HIC法相比，速度更快，是目前应用最广的检测牛奶蛋白质的方法。

2 展望

牛奶的营养成分以酪蛋白为主。从战略上讲，直接测定各种营养蛋白的含量要比间接测定更科学。而测定牛奶中一种或几种特征营养蛋白要比测总蛋白更好，不仅能充分了解牛奶营养成分的实际情况，而且可从根本上杜绝向牛奶中加入非法添加物的行为。

用同时具有分离和定量功能的高效液相色谱法可实现分别测定这些蛋白这一目标。HIC法和RPLC法相比，以RPLC效果更好，应用也最广泛。然而分析时间太长，难以满足批量奶样的现场快速检测需求，必须发展快速HPLC法及快速样品预处理法。快速必然会导致测定准确度的降低，可采用“BioCop”策略[7]中的“生物标记和指纹识别”概念，测牛奶中蛋白特征的“指纹图谱”，在识别是否牛奶中有无“非法的添加物”的同时，实施对牛奶中该特征蛋白指纹图谱中每一种蛋白的定量测定。

参考文献

[1]L.C.Chaplin.Hydrophobic interaction fast protein liquid chromatography of milk proteins[J].J.Chromatogr.，1986，363： 329-335.

[2]Bramanti E， Ferri F， Raspi G， et al. New method for separation and determination of denaturedcaseins by hydrophobic interaction chromatography[J].Talanta，2001，54： 343-349.

[3]G.Bobe，D.C.Beitz，A.E.Freeman，G.L.Lindberg.Sample Preparation Affects Separation of Whey Proteins by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography[J].J Agric Food Chem，1998，46： 1321-1325.

[4]G.Bobe， D.C. Beitz， A.E. Freeman， G.L. Lindberg.Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography[J]. J.Agric Food Chem，1998，46： 458～463.

[5]M.C.Garcia，M.L.Marina，M.Torre.Simultaneous Separation of Soya Bean and AnimalWhey Proteins by Reversed-PhaseHigh-Performance Liquid ChromatographyQuantitative Analysis in Edible Samples[J].Anal Chem， 1997，69：2217-2220.

[6]王娟，张庆合，王志华，等.反相高效液相色谱法同时测定鲜牛乳中的乳清蛋白[J].分析化学，2009，37：1667-1670.

[7]C.Elliott D. Rutledge. Trends in Analytical Chemistry[J]，2010，29（11）：1237-1238.