杀菌温度对羊蝎子风味物质的影响

吴倩蓉，潘晓倩，朱 宁，周慧敏，李 素，张顺亮，刘 梦，赵 冰，王守伟，曲 超

（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

羊肉营养价值丰富，富含蛋白质、钙、磷、维生素等，且胆固醇含量较低，是中国传统的药食同源肉制品，也是冬季进补的佳品[1-3]。自古以来，羊肉就是人们消费的主要肉制品之一，且产量逐年增加，从2015年的441万 t上涨至2018年的475万 t[4-5]。羊蝎子是对羊脊椎骨的俗称，因外形像蝎子而得名，是深受中国人喜爱的美食，富含钙质，利于被人体吸收，但目前对羊蝎子产品的研究基本为空白，且缺乏工业化生产线，需要进行一系列的基础研究以支持工业化的精细化调控。

游离氨基酸是非蛋白氮的重要组成部分，是肉制品中重要的滋味物质以及重要的风味前体物质[6-8]，当疏水性较小时，主要呈现出甜味，如苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸等；当氨基酸疏水性较大时，主要呈现出苦味，如精氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等；当其侧链基团为酸性基团（如—COOH、—SO3H）时，则以酸味为主，如天冬氨酸和谷氨酸，这2 种氨基酸也是形成鲜味物质的重要前体物，与还原糖共同发生美拉德反应，对产品风味有重要贡献[9]。同时，氨基酸受热发生Strecker降解，进行脱胺、脱羧反应生成醇、醛、吡嗪、硫化物等挥发性物质[10-11]。

动态顶空制样-热脱附与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术先通过Tenax-TA吸附管富集样品中的风味物质，再通过GC-MS进行分离鉴定，在肉制品的风味监测中发挥着非常重要的作用[12-14]。气味活度值[15]（odor activity value，OAV）是风味物质浓度与其在水中阈值的比值，用于评价不同种化合物对样品总体风味的贡献。一般而言，OAV大于1的物质，对整体风味有贡献[16]。

电子鼻是模拟动物嗅觉，利用气体传感器的响应曲线识别气味的一种技术，其由4 个部分组成：气体采集流量控制系统、气体传感器阵列（包括10 个金属氧化物传感器）、信号处理子系统和模式识别子系统，具有无损检测、无预处理、实时、快速、灵敏等优点[17]。现已被广泛运用于环境、产品质量检测、医学诊断等各个领域[18-21]。

已有研究表明[22-23]，二次杀菌可大大延长产品的保质期，但对产品的口感、质地、风味和营养品质均有不同程度的影响，121 ℃高温杀菌能够有效杀死产品中的微生物，但对风味损失极大，且容易产生蒸煮味[24]。本研究利用氨基酸分析仪、动态顶空制样-热脱附-GC-MS技术结合电子鼻系统分析，对不同杀菌温度（原料肉、未杀菌样品、90 ℃杀菌样品、105 ℃杀菌样品、121 ℃杀菌样品）的羊蝎子样品中游离氨基酸含量及挥发性风味物质进行检测分析及区分，以期确定使羊蝎子风味保持最佳状态的杀菌温度及工艺条件，为羊蝎子产品的高品质工业化生产提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊蝎子 宁夏盐池县鑫海食品有限公司；煮制用辅料（盐、糖、香辛料等） 北京金美添技术发展有限公司；正己烷（色谱纯） 德国默克公司；2-甲基-3-庚酮标准品、系列正构烷烃 美国Sigma公司；稀盐酸（优级纯）、磺基水杨酸（分析纯） 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

ZT1000#杀菌釜 诸城中泰机械有限公司；L8900氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；Gerstel TDS半自动热脱附进样器、Tenax-TA石英玻璃吸附管、TC-20型Tenax-TA吸附管自动净化仪 德国Gerstel公司；TRACE 1310-TSQ 8000-GC-MS联用仪、TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；动态顶空制样瓶 自制；PEN3电子鼻 德国Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

未杀菌样品：羊蝎子切块→泡净血水→焯水→香料包预煮10 min→大火煮制2 h→真空包装→成品。

90 ℃杀菌样品：羊蝎子切块→泡净血水→焯水→香料包预煮10 min→大火煮制2 h→真空包装→90 ℃杀菌20 min→成品。

105 ℃杀菌样品：羊蝎子切块→泡净血水→焯水→香料包预煮10 min→大火煮制2 h→真空包装→105 ℃杀菌20 min→成品。

121 ℃杀菌样品：羊蝎子切块→泡净血水→焯水→香料包预煮10 min→大火煮制2 h→真空包装→121 ℃杀菌20 min→成品。

产品配方：配料均按照原料质量比例添加：食盐3.5%、白砂糖0.6%、味精0.02%、老抽0.5%、生抽1%；香料包（纱布打包）：大料0.1%、草果0.06%、桂皮0.05%、白芷0.02%、肉豆蔻0.03%、小茴香0.05%、干辣椒1%、花椒0.05%、香叶0.05%、丁香0.05%、葱1.5%、姜1.5%。

共5 个样品，分别为原料肉、未杀菌样品、90 ℃杀菌样品、105 ℃杀菌样品、121 ℃杀菌样品。

1.3.2 游离氨基酸的测定

参照Tanimoto等[25]的方法略作修改。准确称量1.5 g肉样于50 mL离心管中，加入15 mL 0.02 mol/L的稀盐酸并充分均质，超声萃取5 min，随后4 ℃、5 000 r/min离心10 min，收集上清液，在残渣中再次加入15 mL 0.02 mol/L的稀盐酸充分均质并离心，合并上清液并定容至50 mL。移取2 mL定容后的上清液，加入2 mL体积分数8%磺基水杨酸溶液，再次4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.2 μm水相滤膜后，使用L8900氨基酸分析仪进行分析，每个样品重复3 次，结果取平均值。

分析条件：1）分离柱（4.6 mm×60 mm），洗脱液流速0.4 mL/min，柱温70 ℃，柱压11.627 MPa；2）反应柱：茚三酮及其缓冲液流速0.35 mL/min，柱温135 ℃，柱压1.078 MPa。

分别统计5 个样品中总游离氨基酸含量（total free amino acids，TFAA）、必需氨基酸含量（essential amino acids，EAA）、非必需氨基酸含量（non-essential amino acids，NEAA）、EAA/TFAA、EAA/NEAA。

1.3.3 挥发性风味物质的测定

1.3.3.1 样品制备及热脱附程序

切碎并准确称量10 g肉样置于自制的吹扫捕集瓶中，加入1 μL 2-甲基-3-庚酮作为内标物（质量浓度为0.816 μg/μL）后，（55±0.2）℃用TA管富集40 min。氮气流速50 mL/min。每个样品测定3 次，结果取平均值。热脱附及GC-MS程序参考周慧敏[26]、李素[27]等的方法并适当修改调整。

热脱附条件：标准加热模式；氮气流速20 mL/min，不分流；初始温度40 ℃，以40 ℃/min上升至210 ℃并保持5 min；传输线温度215 ℃。

冷进样系统条件：标准加热模式；液氮冷却；初始温度－100 ℃，以10 ℃/min升温至215 ℃并保持5 min；分流比20∶1。

1.3.3.2 GC-MS测定挥发性风味物质

GC条件：TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；用高纯氮气作为载气（＞99.99%），流速1.0 mL/min，不分流；保持2 min。

MS条件：接口温度260 ℃，传输线温度230 ℃；电压1.2 kV；电子电离源温度280 ℃；电子能量70 eV；全扫描模式；质量扫描范围m/z40～600；扫描时间2 s。

1.3.3.3 挥发性风味物质组分分析

通过反相似度指数和正相似度指数均大于800确定化合物（标记为M），通过待测化合物的保留时间与相同条件下正构烷烃的保留时间计算待测化合物的保留指数（retention index，RI），对比文献值（标记为R），RI按式（1）计算：

式中：N为低碳原子数正构烷烃的碳原子数；n为高碳原子数正构烷烃碳原子数差；tx、tN＋n、tN分别为待测化合物保留时间、低碳原子数正构烷烃保留时间和高碳原子数正构烷烃保留时间/min。

根据内标物2-甲基-3-庚酮的含量以及峰面积，计算其他每种化合物相对于内标物的含量，按式（2）计算：

式中：C为测定的挥发性化合物含量/（μg/kg）；Ax为测定挥发性化合物的峰面积/（AU·min）；C0为内标物质量浓度（0.816 μg/μL）；A0为内标物的峰面积/（AU·min）；V为内标物的进样量/μL；m为测定样品的质量/g。

1.3.3.4 OAV的计算

通过计算每种挥发性风味物质的OAV，找出对样品风味有直接影响的物质，当OAV＞1时，则认为该化合物对整体风味有贡献，反之则没有贡献。

OAV为风味物质浓度与其在水中阈值的比值，参照张凯华等[28]的方法，按式（3）计算：

式中：C为实验测定计算所得挥发性化合物含量/（μg/kg）；T为同物质在水中的察觉阈值/（μg/kg）。

1.3.4 电子鼻测定

切碎并称量2 g样品于样品瓶中并加盖密封，使用PEN3电子鼻进行检测，检测温度50 ℃，冲洗时间250 s，空气流速300 mL/min，测试时间90 s。传感信号在60 s之后基本趋于稳定，故本实验选取第70秒的信号进行下一步分析，每个样品重复4 次，电子鼻各传感器对不同物质的响应类型如表1所示。数据采用电子鼻Winmuster软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）。

表1 电子鼻中各个传感器的响应类型Table 1E-nose sensors responding to different odorant compounds

1.3.5 感官评价

参照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评价规范》[29]的相关要求，从色泽、组织形态、口感风味三方面制定感官评价标准，选取10 名食品专业技术人员，经过感官评价培训后，对不同杀菌温度的羊蝎子进行感官评价。实行10 分制，根据评价员喜好程度分段式分别打分，结果取平均值，具体评分标准如表2所示。

表2 感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of spiced lamb spine

1.4 数据分析处理

采用Excel、Origin等数据处理软件对游离氨基酸、挥发性风味物质及感官评价原始数据进行处理，计算平均值、标准差、绘图，并使用SPSS Statistics 21.0进行Duncan显著性差异分析（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌温度羊蝎子中游离氨基酸含量分析

表3 不同羊蝎子样品中游离氨基酸质量浓度Table 3 Free amino acid contents of different lamb spine samples

如表3所示，5 组样品中分别检测出游离氨基酸17、16、16、16、16 种，其中EAA均为7 种，分别为苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。

由表3可知，原料肉样品中TFAA和EAA含量均为最高，分别为378.68 mg/100 g和205.62 mg/100 g，随着加工过程的进行，TFAA和EAA含量均显著降低（P＜0.05），成品中TFAA和EAA含量分别为101.36 mg/100 g和23.84 mg/100 g，这是由于加热过程使样品中的蛋白质发生降解生成游离氨基酸，但游离氨基酸受热也会发生部分降解，同时游离氨基酸作为重要的风味前提物质参与美拉德反应而使其含量减少[30]。

对于不同杀菌温度的样品而言，105 ℃杀菌的样品中TFAA和EAA的含量均为最高，分别为123.19 mg/100 g和27.08 mg/100 g。氨基酸是重要的呈味物质和呈味前体物质，其中天冬氨酸和谷氨酸是肉中鲜味的主要来源，被称为鲜味氨基酸，对样品整体滋味具有重要贡献。105 ℃杀菌的样品中天冬氨酸和谷氨酸含量均显著高于（P＜0.05）其他杀菌温度的样品，这可能是由于温度会促进蛋白质的降解，杀菌温度较低时，蛋白质降解程度也相对较低，故TFAA和EAA含量均较低；而121 ℃杀菌对样品的结构破坏严重，导致大量汁液流失，部分游离氨基酸有可能随汁液流出到汤中，使样品中游离氨基酸含量降低[31]。

2.2 不同杀菌温度羊蝎子中挥发性风味物质分析

表4 不同羊蝎子样品中挥发性风味物质含量Table 4 Relative contents of volatile flavour compounds in different lambspine samples

续表4

使用动态顶空制样-热脱附-GC-MS对原料肉、未杀菌样品以及3 个不同杀菌温度羊蝎子中的挥发性风味物质进行鉴定，结果如表4所示，分别检测到挥发性物质30、40、46、45 种和47 种，包括酯类、醇醚类、醛类、酮类、烃类以及杂环类物质。原料肉中挥发性风味物质总量最低，为1 723.68 μg/kg，随着加工过程的进行，蛋白质受热产生降解，风味前体物质发生美拉德反应以及氨基酸的Strecker降解，同时加工过程中添加的香辛料和辅料也有各自的风味，使未杀菌样品中挥发性风味物质总量显著增加，达到3 450.44 μg/kg。杀菌后样品中挥发性风味物质含量降低，这可能是由于杀菌过程中样品进一步发生了缩合、降解和氧化等反应，使风味物质的含量和种类发生了变化，这与孙承峰等[22]对烧肉中杀菌前后挥发性风味物质含量变化的研究结果一致。

表5 不同羊蝎子样品中挥发性风味物质OAVTable 5 OAVs of volatile flavour compounds in different lamb spine samples

对于不同杀菌温度的样品，105 ℃杀菌样品中检测到挥发性风味物质总量最多，为2 859.24 μg/kg，明显高于90 ℃和121 ℃杀菌的样品，且各类化合物含量也相对较高。这可能是由于温度越高，蛋白质降解程度越高[32]，促进糖和氨基酸发生美拉德反应和Strecker降解反应，生成各类风味化合物，但过高的温度会加速脂类物质的降解和氧化，生成其他物质[33]；随着杀菌温度的升高，醛类物质显著增加，使样品产生过熟味，这与何苗[34]、王明[35]等的研究结果相一致。

如表5所示，5 组样品中对羊蝎子整体风味贡献较大，即OAV大于1的化合物分别有17、24、25、27 种和26 种，远小于由质谱和RI法所确定的挥发性风味物质种类，说明大部分挥发性风味物质都没有气味特征，或其在水中阈值较高，而对产品的整体风味没有明显贡献。由于添加了一系列香辛料和辅料，以及加工过程中蛋白质、脂质降解氧化作用，原料肉中OAV大于1的物质种类明显少于其他组样品。不同杀菌温度的样品中，均检测出OAV较高的醇类、醛类等物质，是羊肉特征性风味的重要组成部分。

2.3 不同杀菌温度羊蝎子电子鼻检测结果分析

图1 不同羊蝎子样品电子鼻检测PCA（A）和LDA（B）图谱Fig.1 PCA (A) and LDA (B) plots of E-nose data for different lamb spine samples

由图1可知，PC1贡献率为93.83%，PC2贡献率为6.03%，累计贡献率达99.86%；LD1贡献率为83.79%，LD2贡献率为13.25%，累计贡献率达97.04%，说明PCA和LDA中，2 个主成分能够完全代表样品的主要信息特征。原料肉与其他样品距离较远，这是由于加入香辛料及辅料共同煮制，形成并产生了各种风味物质；未杀菌样品与杀菌后样品之间也存在一定距离，这可能是由于高温使部分风味物质分解，以及蛋白质、脂质水解产物发生美拉德反应及Strecker降解而产生新的风味物质造成的；图1A中，105 ℃杀菌及121 ℃杀菌部分重叠，表明产生的风味物质相似，图1B中，3 种杀菌温度样品没有重叠，结合PCA和LDA图谱分析，可以良好区分不同杀菌温度羊蝎子样品，为羊蝎子产品的质量分级等后期研究提供理论支持。

2.4 感官评价结果

图2 不同杀菌温度羊蝎子感官评分Fig.2 Sensory scores of spiced lamb spine sterilized at different temperatures

如图2所示，随着杀菌温度的升高，样品色泽、组织形态和口感风味都发生了显著的变化。从色泽上看，杀菌温度对于色泽的影响不显著（P＞0.05）；随着杀菌温度的升高，样品组织形态评分显著降低（P＜0.05），说明热处理会造成蛋白质发生变性和降解等反应，使肌肉组织变软，弹性下降；从口感风味上看，杀菌后样品评分均显著低于未杀菌样品，但105 ℃杀菌样品评分显著高于90 ℃和121 ℃杀菌样品（P＜0.05），说明加热处理一方面可以促进美拉德反应和Strecker降解反应的进行，同时也会导致脂质的变化，造成风味的改变。整体来看，105 ℃杀菌样品的评分最接近于未杀菌样品，而121 ℃杀菌样品评分显著低于其他样品（P＜0.05），这与付丽[36]、李迎楠[37]、赵冰[38]等对不同杀菌条件对酱牛肉、清酱肉及乳化香肠品质影响的研究结果一致。

3 结 论

对不同杀菌温度的羊蝎子样品中游离氨基酸含量和挥发性风味物质进行检测分析，原料肉、未杀菌样品、90 ℃杀菌样品、105 ℃杀菌样品及121 ℃杀菌样品中分别检测出游离氨基酸17、16、16、16、16 种，其中必需氨基酸均为7 种，熟制后样品中TFAA和EAA含量均显著降低，对于不同杀菌温度的样品，105 ℃杀菌样品中TFAA和EAA的含量均为最高，分别为123.19 mg/100 g和27.08 mg/100 g，且天冬氨酸和谷氨酸含量均显著高于（P＜0.05）其他杀菌温度的样品，对羊蝎子的整体滋味具有重要贡献。5 组样品中分别检测出挥发性风味物质30、40、46、45 种和47 种，总量分别为1 723.68、3 450.44、1 977.25、2 859.24、2 097.29 μg/kg，未杀菌样品中检测到挥发性风味物质总量最多，杀菌后均有所降低，但105 ℃杀菌样品中挥发性物质总量显著高于90 ℃和121 ℃杀菌的样品（P＜0.05），各类化合物含量以及OAV大于1的物质种类也相对较高。结合电子鼻系统分析，综合PCA和LDA图谱，能够区分不同杀菌温度羊蝎子的整体风味。感官评价结果表明，105 ℃杀菌样品在口感风味上显著优于其他杀菌温度的样品（P＜0.05），且整体评分最接近未杀菌样品。综合以上结论，105 ℃杀菌的羊蝎子样品风味品质明显优于其他杀菌温度的样品，为羊蝎子的高品质工业化生产提供理论支持。