猪细小病毒与圆环病毒3型双重PCR方法的建立与应用

李原野，李敏，李桂黎，黄迪，徐志文，朱玲，岳建国*

（1.四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

猪圆环病毒3型（PCV3）和猪细小病毒（PPV）都存在使患病母猪受孕率降低，流产率增加，产死胎或木乃伊胎；患病仔猪多系统功能紊乱等情况[1-3]。临床上对这两种病的混合感染很难做出鉴别诊断，故本研究建立了可以同时检测猪圆环病毒3 型和猪细小病毒的双重PCR 方法，以了解四川地区PCV3和PPV混合感染的情况，为新出现的PCV3的临床诊断及流行病学调查提供依据。

1 材料

1.1 病毒和病料 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪圆环病毒3型（PCV3）阳性病料、猪细小病毒（PPV）、大肠杆菌，均由四川农业大学生物技术中心保存。67份临床组织样品采集自四川省眉山市、青神县、洪雅县等大型规模化猪场。

1.2 主要试剂 Trizol、Taq PCR Master Mix、pMD19-T 载体、DL2000 DNA Maker、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒，均购自生物工程（上海）有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit(反转录试剂盒)，购自宝生物（大连）有限公司。

2 方法

2.1 引物的设计与合成 PPV NSP-1 基因的保守性较好，是分子诊断的常用目的片段；而PCV3的高度保守序列是ORF2基因。根据GenBank已发表的PCV3（Accession：MF139082.1）、PPV（Accession：MF447833.1）基因的核苷酸序列，分别设计一对特异性引物PCV3-F、PCV3-R 和PPV-F、PPV-R，其扩增产物片段的大小分别为651bp 和353bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（详见表1）。

表1 引物序列与产物长度

2.2 样品处理以及病毒核苷酸的提取 将从67份疑似PCV3和PPV病料中筛选出来的5份PCV3阳性病料和17份PPV阳性病料，分装并编号。按照编号的病料（肺组织、肺淋巴结、流产胎儿）取样5 g，放入研钵中，剪碎至无明显的颗粒状，加入液氮进行研磨，磨至粉末状，加入适量的生理盐水，将病料进行10 倍稀释，-20 ℃反复冻融3 次，12 000 r∕min 瞬离20 s，取上清至EP 管中，保存备用。

用Trizol 法[4]提取PRRSV、PRV、CSFV、PEDV的病毒液以及研磨病料的总RNA，放置-80 ℃保存备用。将提取的总RNA 分别使用反转录试剂盒转录成cDNA，-20 ℃保存备用。

2.3 单项PCR 扩增 将上面提取的cDNA 作为模板，通过对引物量的优化、模板稀释梯度优化、退火温度的优化等探索最佳反应体系，发现25 μL 反应体系最佳，该反应体系为：2×PCR Mix Buffer 12.5 μL，上下游引物各1 μL（浓度为10 μM），cDNA模板2 μL，剩余通过加ddH2O进行补充。PCR反应程序如下：

PCV3：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃7 min。PPV：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共30个循环；72 ℃7 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4 目的片段的克隆及回收 使用胶回收试剂盒将琼脂糖电泳出的目的条带回收，将回收的目的条带连接至pMD19-T 载体，再转化入DH5α克隆菌中，挑取阳性克隆菌送至生物工程（上海）有限公司测序，将经测序鉴定后的阳性样品进行扩大培养，用质粒抽提试剂盒分别提取含有两个目的片段的两种质粒作为双重PCR的反应模板。

2.5 双重RT-PCR方法的建立以及反应体系的优化

2.5.1 PCV3、PPV 双重PCR 反应退火温度的优化 以PCV3和PPV各自反应的最佳退火温度为基础，运用Primer 6.0 软件预测双重PCR 的最佳退火温度范围，设置多个梯度的退火温度（51.2、

52.0、52.8、53.7、54.5、55.2、56.1、57.2、58.4、59.8 ℃）进行反应，最终筛选出最佳退火温度。

2.5.2 PCV3、PPV双重PCR反应引物量的优化 以单项PCR为基础，进行25 μL的双重PCR试验，加入浓度为10 μM 的不同引物量（0.5、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 μL）分别进行反应，最终筛选出最佳引物量。

2.6 特异性试验 运用已经建立的双重PCR，取等量PRV 病毒的DNA 以及RNA 病毒PRRSV、CSFV、PEDV反转录的cDNA作为模板进行反应，并用水代替模板阴性对照，将PCV3 和PPV 两种阳性病料进行PCR扩增，扩增出的产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并分析。

2.7 敏感性试验 将两种含PCV3和PPV基因的重组质粒用核酸蛋白仪测定浓度，然后分别以100～108的浓度梯度稀释，利用已经优化好的PCR 反应体系进行PCR 扩增，通过1.5%凝胶电泳，确切找出出现阳性条带的最高稀释浓度，推算其最低检出浓度。

2.8 重复性试验 将PCV3和PPV阳性病料提取出的DNA，利用所建立的双重PCR方法分别进行检测，重复5次，用于验证所建方法的重复性。

2.9 双重PCR 和单项PCR 的临床应用 用建立好的双重PCR 方法对67 份临床组织样品进行检测，同时用本实验室已经建立的两种病毒的单项PCR作检测，产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以验证该方法的实用性。

3 结果

3.1 单项PCR 扩增 将从阳性病料中提取的DNA 运用本实验室已经建立的反应体系进行退火温度的优化，结果呈现的目的条带与预期353 bp 和651 bp 相一致，同时得出最佳的退火温度为：PCV3 53 ℃，PPV 56 ℃。

3.2 双重PCR反应体系的优化

3.2.1 退火温度的优化 双重PCR 反应的最佳退火温度在54.5 ℃～55.2 ℃之间，所以选取55 ℃作为该方法的最佳退火温度。

3.2.2 引物量的优化 引物的最佳用量为1 μL，浓度均为10 μM。

3.3 双重PCR反应条件的优化 根据上述所知的反应最佳退火温度与最佳引物量，对双重PCR的反应条件进行优化，通过对退火时间、延伸时间和循环数的优化，最终得到最佳的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共33个循环；72 ℃7 min。

3.4 双重PCR的特异性检测 运用上述最佳反应条件及最佳反应体系，进行双重PCR反应的特异性检测。结果表明，只有阳性病料扩增出了条带，其余病毒未扩增出条带（图1），体现出该反应具有特异性。

图1 双重PCR的特异性检测

3.5 双重PCR 的敏感性测定 将两种质粒按照100～108浓度标准稀释，运用已经建立好的双重PCR 方法将两种质粒混合，并进行扩增反应，结果表明稀释到108浓度时，PCV3 和PPV的混合质粒可以扩增出条带（图2），因此，可以推算出PCV3、PPV 的最低检出量为3.12×105copies∕μL。

图2 双重PCR的敏感性检测

3.6 双重PCR的重复性检测 运用所建立的双重PCR方法对含有PCV3和PPV的阳性病料检测5 次后，结果显示一致（图3），表明本方法的重复性较好。

图3 双重PCR的重复性检测

3.7 双重PCR的临床应用 将从成都周边地区采集的67 份病料提取总DNA，根据本文所建立的双重PCR 方法进行检测，检测过程中设置阴性、阳性对照。将PCR 产物各吸取10 μL 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示：PCV3单一感染率为7.46%（5∕67），PPV 单一感染率为25.37%（17∕67），PCV3+PPV 复合感染率为1.49%（1∕67）。该结果与单项特异性PCR检测结果完全符合。

表2 双重PCR检测67份病料PCV3和PPV的结果

表3 单项PCR与双重PCR的检测结果对比

3.8 目的片段的基因序列验证 运用建立的双重PCR方法扩增出目的片段，对扩增产物进行测序，所得序列经过NCBI BLAST比较分析，结果表明，PCV3 的扩增序列与参考毒株（MF139082.1）的同源性为99%，PPV 的扩增序列与参考毒株（MF447833.1）的同源性为99%。证明运用本方法可以成功扩增出PCV3 和PPV 的目的片段，也证实该方法具有较好的特异性，在实验室诊断上具有很大的价值。

4 结论

本次建立的双重PCR 方法可在一个反应体系中实现PCV3 和PPV 混合基因的同时扩增，最终扩增出的目的条带与参考毒株的同源性高达99%，表明其特异性较好；所检出的最低拷贝数为3.12×105copies∕μL，灵敏度较高。运用该方法对67份临床样品进行检测，其最终结果与单项PCR的符合率为100%。本研究首次建立了可以同时检测PCV3 和PPV 的双重PCR 方法，对这两种病的诊断更加快速、简便、准确，为临床上PCV3 和PPV 混合感染的鉴别诊断以及流行病学分析提供了重要的技术支持。■