基于代谢组学分析云南滇红和墨红玫瑰花色差异*

施 蕊，钱晓慧，栾云鹏，陈 黎，陈龙清△

（1.西南林业大学园林园艺学院，云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南 昆明 650224；2.大理花之隐农业发展有限公司，云南 大理 671003）

近年来，大多数人对植物的次生代谢产物进行了的研究[1-3]。黄酮类化合物作为最大的次级代谢产物，有着重要的生物学功能，在植物的花瓣中可以产生大量的次生代谢产物，这不仅为花朵提供各种颜色和香味，促进受粉完成繁殖，还成为植物代谢组学中研究的理想模型系统[4]。中国的玫瑰品种很多，如苦水玫瑰[5]、中国玫瑰、墨红[6]等，但是大部分可以食用的是重瓣玫瑰。因为单瓣玫瑰中单宁酸含量是重瓣玫瑰得几十倍以上，多吃不宜。以前研究发现，滇红和墨红花色不同，口感也稍有不同，种植方式、生长周期与环境适应性也不同，但尚未研究两种玫瑰花瓣中所含的黄酮类物质的组成、含量，以及黄酮类物质的代谢途径有何差异。

墨红Rosa L.‘Crimson Glory’和滇红R.gallica L.‘Dianhong’属于云南主栽的可食用重瓣玫瑰[7]。它们花瓣数多，而且层厚，可用来制茶，做酱汁，酿葡萄酒等[8]，也适合提取其色素以及糖类、蛋白质、微量元素等营养成分[9]。滇红和墨红花瓣的颜色是分别为紫色和红色，植物的花色主要由3种类型的物质决定：类黄酮，类胡萝卜素和生物碱[10]。黄酮类化合物是苯丙烷类化合物的次生代谢产物，可使花朵呈现粉红色、红色、蓝色、紫色和黄色[11]。类胡萝卜素的颜色范围较广，是形成黄色、橙色至红色花的主要色素物质[12]。对整个植物代谢组的更全面了解将有助于理解不同花色植物中的色素化学及其相关的生物合成途径[13]。黄酮具有清除羟基自由基，超氧阴离子自由基和脂质过氧自由基的能力，这表明许多黄酮具有促进人体健康的功能[14]。但是，并非所有的类黄酮及其作用都是有益的。一些类黄酮具有诱变和促氧化剂作用，并会干扰基本的生化途径[15]。因此，采用代谢组学检测方法探讨了两种食用玫瑰中黄酮类代谢组的差异，揭示玫瑰色差异的原因，为玫瑰花色的进一步开发和食品利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料 供试材料墨红（DH）和滇红（ZY）玫瑰采自云南省大理白族自治州（N25°44′14″，E100°9′50″），海拔 1 970 m，见图 1。

甲醇（Merck）、乙腈（Merck）、乙醇（Merck）为色谱纯。

研磨仪（MM 400，Retsch）；微孔滤膜（0.22 μm pore size）；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chrom-atography，UPLC）；串联质谱（Tandem mass spectrometry，MS/MS）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取 花瓣先真空冷冻干燥，再利用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状后称取 100 mg的粉末，溶解于1.0 mL提取液（70%的甲醇水溶液）中；溶解后的样品4℃冰箱过夜，期间涡旋3次，提高提取率；离心（转速 10 000 g，10 min）后，吸取上清，用微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2 样品测定 液相条件主要为流动相：水相为超纯水（加入0.04%的乙酸），有机相为乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脱梯度：0 min水/乙腈（95∶5 V/V），11.0 min为 5∶95 V/V，12.0 min 为 5∶95 V/V，12.1 min为 95∶5 V/V，15.0 min为 95∶5 V/V；流速0.4 mL/min；柱温 40 ℃；进样量 5 μL；质谱条件主要为：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度550 ℃，质谱电压 5 500 V，帘气（curtain gas，CUR）25 psi。

1.3 数据分析 基于UPLC-MS/MS检测平台，利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，数据库和多元统计分析相结合，研究两个品种之间的代谢组差异。

2 结果与分析

2.1 类黄酮代谢产物的定性和定量分析 对滇红（ZY）和墨红（DH）玫瑰花瓣进行类黄酮代谢组检测，2组样本中共检测到174种黄酮类代谢产物。包括括67种黄酮类、37种黄酮醇类、11种黄烷酮类（二氢黄酮类）、14种花青素类、3种异黄酮类、12种黄烷醇类、7种黄酮碳糖苷类，14种原花青素类，2种查耳酮类，4种二氢黄酮醇类，3种鞣质类。

2.2 主成分分析 主成分分析（PCA）是一种多元统计分析工具，可以利用更少的主成分以显示多个变量之间的内在的与结构[16]。PCA结果显示3组之间黄酮类代谢物呈分离趋势，组间呈聚集状。在图2中3个主要成分PC1，PC2和PC3分别为83.79%，7.55%和4.96%。结果表明，不同处理样品之间存在明显差异，组内稳定性良好。进而说明不同颜色的玫瑰中黄酮类化合物的积累方式也不同。

2.3 聚类相关性分析 聚类图显示，两个品种之间的类黄酮积累模式存在显着差异（图3）。 DH（墨红），mix01（滇红和墨红混样 01），mix02（滇红和墨红混样02）和mix03（滇红和墨红混样03）分组为一个群集，ZY（滇红）分组为另一群集（图4）。

2.4 差异代谢物筛选及分析 差异代谢物筛选标准为VIP≥1且FC≥2和FC≤0.5。与对照相比，滇红（ZY）产生的显著差异代谢物共96种，其中上调差异代谢物73种，主要为黄酮醇类和黄酮类，其中异黄酮类、黄酮碳糖苷和鞣质这3类只参与上调（图5）。下调差异代谢物23种，主要为黄酮醇类和黄酮类。如图6，筛选出DH与ZY先相比差异倍数较大的代谢物，上调的前10依次分别为山奈酚-O-乙酰葡萄糖、二氢异鼠李素-O-戊糖苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷、金圣草黄素、异泽兰黄素葡萄糖苷、杨梅黄酮3-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、5，7，4′，5′-四羟基-3′，6-二甲氧基黄酮、鹰嘴豆素7-O-葡萄糖苷（印度黄檀苷）、芹菜素、煅树素（金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷）；下调的前10依次分别为 原花青素 A3、木犀草素O-芥子酰己糖苷、金圣草黄素5-O-己糖苷、3-O-（5-葡糖基-3-羟基-3-甲基谷氨酸）-葡萄糖、（-）-表阿夫儿茶精、山奈酚-O-戊糖苷-O-二已糖苷、乙酰己糖苷异鼠李素、没食子酸 O-阿魏酰己糖苷-O-己糖苷、异鼠李亭丙二酸己糖、异鼠李素O-乙酰己糖苷。

2.5 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析 利用KEGG数据[17]进行分析发现，差异代谢物不止参与1条代谢通路，有可能2条甚至多条代谢通路。（-）-表没食子儿茶素参与了类黄酮生物合成和次生代谢产物的生物合成2条代谢途径；牡荆素参与了类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成两条代谢途径；金合欢素参与了黄酮和黄酮醇生物合成1条代谢途径；氯化天竺葵色素苷参与了花青素的生物合成1条代谢途径；李属异黄酮（樱黄素）参与了异黄酮的生物合成1条代谢途径；五羟黄酮参与了类黄酮生物合成1条代谢途径；丁香亭参与了黄酮和黄酮醇生物合成1条代谢途径；山奈酚参与了类黄酮生物合成、次生代谢产物的生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、花青素的生物合成、异黄酮的生物合成、苯丙烷的生物合成、代谢途径5条代谢途径；（-）-表阿夫儿茶精参与了类黄酮生物合成、次生代谢产物的生物合成2条代谢途径；木犀草素参与了类黄酮生物合成、次生代谢产物的生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、代谢途径4条代谢途径；牡荆素-2-O-鼠李糖苷参与了黄酮和黄酮醇生物合成1条代谢途径；鹰嘴豆素7-O-葡萄糖苷（印度黄檀苷）参与了异黄酮的生物合成1条代谢途径；木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷参与了黄酮和黄酮醇生物合成1条代谢途径；五没食子酰葡萄糖参与了苯丙烷的生物合成一条代谢途径；松黄烷酮参与了类黄酮生物合成1条代谢途径；芹菜素参与了类黄酮生物合成、次生代谢产物的生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、异黄酮的生物合成、苯丙烷的生物合成、代谢途径6条代谢途径；金圣草黄素参与了黄酮和黄酮醇生物合成1条代谢途径。

这些差异代谢物及相应的代谢途径调控了云南滇红和墨红玫瑰颜色的差异。参与差异代谢物调节的代谢通路共有7条，分别是类黄酮生物合成、次生代谢产物的生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、花青素的生物合成、异黄酮的生物合成、苯丙烷的生物合成、代谢途径。利用KEGG数据进行分析发现差异代谢物显著富集在黄酮和黄酮醇生物合成，类黄酮生物合成和次生代谢物的生物合成（图7）。其中注释到黄酮和黄酮醇生物合成下的代谢物个数占被注释上的代谢物总数比例最大，其次为类黄酮生物合成和次生代谢产物的生物合成（图8）。

获得以上结果后进一步将差异代谢物在KEGG图上标注，类黄酮生物合成途径中（-）-表没食子儿茶素、牡荆素、山奈酚、木犀草素、松黄烷酮、芹菜素显著上调；五羟黄酮和(-)-表阿夫儿茶精显著下调（图9）。黄酮和黄酮醇生物合成途径中牡荆素、丁香亭、山奈酚、木犀草素、牡荆素-2-O-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、金圣草黄素、金合欢素显著上调。这些不同的代谢产物和相应的代谢途径调节滇红和墨红玫瑰颜色的差异（图10）。

3 讨论与结论

墨红和滇红含有174种类黄酮代谢物，黄酮类化合物大部分具有不同作用。异黄酮代谢性地来自黄烷酮，同时异黄酮是参与植物抗毒素生物合成的许多重要化合物的前体[18]。原花青素不仅对蛋白质代谢具有有益的作用，还能改善动物健康，并以可持续的方式改善农业[19]，它也可用于食品工业，例如葡萄籽中的原花青素，作用于抗氧化剂，抗微生物剂，抗肥胖，抗肥胖糖尿病，抗神经变性，抗骨关节炎，抗癌和保护心脏和眼睛等[20]。此外，差异代谢物芹菜素参与了6种代谢途径。芹菜素的致畸变毒性与其他黄酮类化合物比相对较低，还能够通过多靶点、多通路潜在改善炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、肿瘤和糖尿病等[21]。花青素是水溶性色素，不仅有色彩和营养特性，还具有作用于食品的感官特性[22]。可见滇红和墨红作为可食用的经济作物，对于进一步发展为天然色素，成为有食用或保健功能食品，以及天然食材的调味料具有很大潜力。

通过功能注释和差异代谢物的富集分析，笔者发现差异代谢物主要参与了黄酮和黄酮醇生物合成，类黄酮生物合成和次生代谢物的生物合成。黄酮和黄酮醇生物合成，类黄酮生物合成中差异积累的代谢产物可能是两种玫瑰之间色差的关键。这为进一步解释两种玫瑰的花色、口感以及营养成分的不同提供了参考，也为这两种玫瑰进一步进行花色遗传育种奠定了基础。

云南滇红玫瑰与墨红玫瑰是世界玫瑰花卉市场上比较著名的两个品种，本研究发现，两种花瓣中所含的黄酮类物质基本相同，但所含黄酮类物质比例、黄酮类代谢物以及黄酮类化合物的积累、代谢模式都有差异。本研究为两种近亲植物在食用玫瑰深加工方向的研究奠定了理论基础。