芍药甘草汤治疗多囊卵巢综合征高雄激素血症的网络药理学研究*

楚丽杰，刘 卉，罗文连，张 涵，杨宝玉

（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院妇科，山东 济南 250014）

高雄激素血症（hyperandrogenemia，HA）是一种以雄激素过多为生化指标，月经异常、痤疮、多毛、脱发等为临床表现的疾病[1-2]。其诱因包括多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、肾上腺皮质增生、雄激素分泌性肿瘤等，约95%的HA妇女患有PCOS[3]。HA不仅是PCOS的病理学特征之一，也是其核心病因[4]，HA可抑制卵泡的发育和成熟，不能形成优势卵泡，从而影响排卵与行经[5]，并且增加子宫内膜癌、糖尿病和心脑血管疾病的发生率。因此，对HA的干预成为PCOS诊治的核心举措之一。

芍药甘草汤出自《伤寒杂病论》，历代医家对本方的作用趋同于白芍酸敛补益阴血，甘草补益中焦。白芍的关键作用在于抑木扶土、疏泄破积。甘草有敛降太阴脾气的作用，通过降以为补，达到恢复脏腑阴阳之功效[6]。王好古在《汤液本草》中提出了肝苦急，以甘草之甘缓之、白芍之酸泻之等处方用药规律。临床研究表明，芍药甘草汤可有效作用于HA及PCOS[7-10]。现代药理学研究显示，芍药甘草汤可以降低睾酮值，使其转变为雌激素[11]，提高了HA患者的生活质量。

中医药通过多成分、多靶点、多通路发挥作用。虽然芍药甘草汤干预多囊卵巢综合征高雄激素血症的作用明确，但关于其发挥作用的主要成分、潜在靶点、生物过程等研究少见。本次通过网络药理学方法，分析、预测芍药甘草汤的成分、靶点及作用于多囊卵巢综合征高雄激素血症的药物机理。

1 材料与方法

1.1 芍药甘草汤有效活性成分的检索与筛选 通过TCMSP数据库（中药系统药理学数据库与分析平台）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索白芍、甘草的所有活性成分，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、半衰期（half-life period，HL）、类药性（drug-like property，DL）是筛选的关键参数，以 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h为标准，筛选出符合条件的有效活性成分。

1.2 芍药甘草汤潜在靶点收集及可视化网络构建利用TCMSP数据库搜索白芍、甘草有效活性成分的作用靶点。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库，物种设定为“人”，将所获得的靶点进行名称转换，以解决中药靶点存在的名称不标准问题。借助Cytoscape3.7.2软件构建芍药甘草汤“中药-活性成分-靶点”可视化网络。从而得到芍药甘草汤治疗多囊卵巢综合征高雄激素血症的主要有效活性成分。

1.3 疾病靶点的检索与预测 以“polycystic ovary syndrome hyperandrogenemia”为关键词，运用Genecards、Drugbank、OMIM数据库获取多囊卵巢综合征高雄激素血症的治疗靶点。

1.4 药物与疾病靶点的匹配及蛋白互作网络（PPI）构建 利用VENNY图将芍药甘草汤有效活性成分作用的靶点与疾病的靶点进行匹配，得到芍药甘草汤与多囊卵巢综合征高雄激素血症的共同靶点。将共同靶点上传至STRING 11.0数据库（https：//string-db.org/），将物种设置为“Homo sapiens”，构建 PPI图。并借用Cytoscape3.7.2软件中的MCODE插件，筛选出PPI中的关键靶点，以获得芍药甘草汤治疗多囊卵巢综合征高雄激素血症的关键靶点。

1.5 基因功能及作用通路分析 运用David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对关键靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，阐明芍药甘草汤对多囊卵巢综合征高雄激素血症的生物学功能及相关信号通路。

2 结果

2.1 白芍、甘草的有效活性成分及作用靶点 借助TCMSP数据库，以 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h为标准，共得到83个有效活性成分，其中白芍10个，甘草76个，重合3个。运用TCMSP数据库，搜索活性成分作用靶点，共得到1 482个，剔除重复后得到244个。将其借助Uniprot数据库进行名称转化，删除“人”中没有的，最终得到233个。

2.2 芍药甘草汤“中药-活性成分-靶点”可视化网络构建 将白芍、甘草的有效活性成分及作用靶点上传至Cytoscape3.7.2软件，构建芍药甘草汤“中药-活性成分-靶点”可视化网络，见图1。其中红色正方形代表2种中药白芍、甘草；蓝色圆形代表中药所对应的活性成分，其大小与活性成分所对应的靶点数目呈正比；黄色圆形代表2种中药的共有活性成分。将degree排名前10的活性成分与对应靶点的数目整合至表格中，见表1。由此得出排名最前的活性成分为槲皮素，其次为山奈酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、刺芒柄花素等。

表1 芍药甘草汤中靶点数目排名前10的活性成分

2.3 多囊卵巢综合征高雄激素血症的相关靶点运用Genecards数据库，获得103个基因，删除重复后得101个；运用Drugbank数据库，以“Targets”为条件，共得到98个靶点，借助Uniprot数据库进行基因转化，删除重复及“人”中没有的，得到77个基因；运用OMIM数据库，以“gene with known sequence”为筛选条件，共得到4 860个基因，删除1个重复基因后共得到4 859个。将3个数据库的基因整合，去除重复后共得到4 947个。

2.4 药物与疾病靶点匹配及PPI网络构建 利用VENNY图将芍药甘草汤与多囊卵巢综合征高雄激素血症的靶点进行匹配，获得共同靶点125个，见图2。将共同靶点上传至STRING数据库，物种选为“Homo sapiens”，置信度≥0.40，构建 PPI网络，将所获得的数据下载为TSV格式，将数据导入Cytoscape3.7.2软件，以中位数（degree值）>35为标准，筛选出PPI中的关键靶点，见图3。靶点大小与degree值呈正比，靶点越大代表所发挥的作用越强，获得41个关键靶点。根据degree值排序，排名前15的靶点基因见表2。

表2 排名前15的关键靶点

2.5 GO基因功能富集分析 将41个关键靶点上传至David数据库中的基因列表，标识码为OFFICIAL GENE SYMBOL，清单类型为基因表，选择物种为“Homo sapiens”，对关键靶点进行GO富集及KEGG通路分析，设定阈值P＜0.01。将GO富集结果按P值由小到大排序，P值的大小与富集程度呈负相关，排名靠前的结果见表3，其中12个靶点参与了蛋白质磷酸化的正调控，8个靶点参与了脂多糖介导的信号通路，9个靶点参与了NF-κB转录因子活性的正调控，8个靶点参与了细胞对缺氧的反应等。2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析主要涉及107条通路，以P值为排序标准，P值的大小与关联程度呈负相关，其中与多囊卵巢综合征高雄激素血症密切相关前20条通路包括癌症通路、TNF、HIF-1、FoxO、Toll样受体、催乳素等信号通路，见表4。

表3 GO功能富集分析

3 讨论

HA是PCOS的一个重要病因，可呈现出一系列生殖系统结构及功能异常症候群，雄激素对妇女健康的最显著影响是PCOS妇女的HA[12]。“中药-活性成分-靶点”可视化网络图看出，芍药甘草汤治疗的主要活性成分是槲皮素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、刺芒柄花素等。槲皮素能降低CYP17A1基因的表达，从而抑制磷脂酰肌醇3-激酶以减少雄激素的合成[13]，刺芒柄花素可通过调节NF-κB信号通路的表达，来影响炎症因子的呈现[14]，进而抑制了雄激素的合成。槲皮素与山奈酚都属于黄酮类化合物，具有明显的抗炎作用[15]，炎症因子水平往往与雄激素水平呈正相关[16]。由此得出，芍药甘草汤主要通过抗炎特性来发挥治疗疾病的作用。

PPI网络分析发现，MAPK3、TNF、MMP9、IL-6、STAT3、VEGFA等是芍药甘草汤治疗本病的关键靶点。MAPK3在卵泡发育及排卵过程中发挥着重要的作用[17]，其可能受雄激素调节，在PCOS中的表达下降[18]。Karimzadeh L 等[19]发现通过抑制 IL-6、COX-2、VEGF、TNF等可降低PCOS患者的雄激素水平。另有发现 PCOS患者的 MMP9、STAT3浓度较高[20-21]，STAT3可以促进IL-6发挥其抗炎特性，MMP9可通过释放VEGF参与血管生成。由此可知，芍药甘草汤可以上调MAPK3促进排卵及卵泡黄素化，通过作用于 MMP9、STAT3 来抑制 TNF、IL-6、VEGF 等炎症和血管生成因子，以达到干预疾病的目的。

GO富集分析显示，芍药甘草汤可参与蛋白质磷酸化的正调控、脂多糖介导的信号通路、NF-κB转录因子活性的正调控、细胞对缺氧的反应等生物过程。NF-κB通路可以通过介导脂多糖来促进IL-6的表达[22]。氧化应激和缺氧会加速AGE前体的产生，导致转录因子NF-κB的激活，进而形成HA[23]。以上研究说明了芍药甘草汤通过多个生物学过程来治疗本病。

KEGG通路分析显示，芍药甘草汤可作用于癌症、TNF、HIF-1、FoxO、Toll样受体等信号通路。雄激素水平升高可增加子宫内膜增生、癌变的风险[24-25]。Torchen LC等[26]将HA妇女与非HA妇女相比，患转移性肿瘤和糖代谢障碍的风险增加。TNF-α水平在PCOS患者中显著升高，大幅度增加了初级卵泡的数目[27]。HIF-1α及其下游蛋白内皮素-2对卵泡的发育及排卵发挥重要的作用[28]，而其在PCOS大鼠卵巢被显著抑制[29]。FoxO可抑制PCOS巨噬细胞中葡萄糖的摄取[30-31]，并促其产生炎性细胞因子[32]。雄激素会导致脂肪分解，增加游离脂肪酸，而游离脂肪酸的主要配体是Toll样受体[33]。说明芍药甘草汤不仅可调节糖脂代谢、保护血管内皮、参与炎症反应，还可作用于多囊卵巢综合征高雄激素血症的远期并发症。

综上所述，芍药甘草汤中槲皮素、山奈酚、刺芒柄花 素 等 可 通 过 MAPK3、TNF、MMP9、IL-6、STAT3、VEGFA 等靶点作用于 TNF、HIF-1、FoxO、Toll样受体等信号通路来调节糖脂代谢、保护血管内皮、参与炎症反应，以减少雄激素的合成。另外，本研究发现，7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇等也可能是主要活性成分，MYC、PTGS2、EGFR、MAPK1、AKT1、TP53 等可能是其作用靶点，乙型肝炎、催乳素信号通路、胰岛素抵抗等可能是其作用通路，为今后深入探讨芍药甘草汤干预多囊卵巢综合征高雄激素血症的作用机制开辟了新思路。