囊胚复苏扩张程度可作为预测优质单囊胚FET妊娠结局的重要参数

吴方贵，田菁燕，彭倩雯，董倩，刘尚杰，张敏旗

(深圳大学第三附属医院(深圳市罗湖区人民医院)生殖医学科，深圳 518001)

随着辅助生殖技术的发展和完善，囊胚培养成功率逐步提高，囊胚移植比卵裂期胚胎移植可以获得更好的妊娠结局。在临床实践中，美国生殖医学协会倡导的“移植一个胚胎，获得一个健康孩子”理念成为更多生殖中心的选择[1]，单囊胚移植成为主要手段。现有的研究表明，囊胚形态学选择主要依赖于其发育速度、内细胞团和滋养层等因素的评价[1]；对于优质囊胚而言，其发育时期和/或内细胞团、滋养层情况并不影响单囊胚移植的临床妊娠率[1]。而单囊胚移植中复苏囊胚的扩张状态对于临床结局的影响尚未见报道。我们探索2019年在本中心部分冻融胚胎移植(FET)周期中，原始扩张囊胚经过解冻复苏后扩张程度和妊娠结局的相互关系，探讨单囊胚移植中复苏囊胚扩张程度对于胚胎选择的影响。

资料和方法

一、研究对象

选择本生殖中心2019年3月17日至2019年12月31日的FET周期数据(总计1 204例样本)，以优质单囊胚移植样本为具体研究对象。

纳入标准：女方年龄21～40岁；囊胚经过激光皱缩后冷冻；移植胚胎均来源于2PN胚胎；FET周期；单囊胚移植；优质囊胚(发育时期Ⅲ期及Ⅲ期之后，内细胞团和滋养层均为B级以上评分)；内膜转化日子宫内膜厚度>7 mm。

同时满足上述所有纳入标准样本为研究对象，总共入组190例。

根据冷冻复苏培养2 h后囊胚扩张是否超过50%、100%或出现孵化为分组标准，探究原始扩张囊胚经过冷冻复苏后，不同囊胚扩张状态和妊娠结局。

二、囊胚FET周期回顾

1.囊胚培养及评分说明：体外授精后于37℃、6%CO2、5%O2环境下G1 plus卵裂期培养液(Virtrolife，瑞典)中培养至第3天后，转移至G2 plus囊胚培养液(Virtrolife，瑞典)中继续培养，受精后第5、6日观察胚胎发育情况，按照Gardner评分标准[2]对囊胚进行评分。优质囊胚为受精后第5及第6日为Ⅲ期及Ⅲ期以上、内细胞团(ICM)及滋养层细胞(TE)均为B级及以上者。

2.囊胚冷冻与复苏：囊胚冷冻前均行激光皱缩，30 min内进行玻璃化冷冻。冷冻/解冻参照日本加藤公司试剂盒说明书操作。室温下将囊胚放入平衡液(ES)中10～12 min，然后将囊胚转移至玻璃化冷冻液中45～60 s后将囊胚置于冷冻载杆上，迅速浸入液氮中保存。解冻时将载杆迅速浸入37℃解冻液(TS)中，1 min内将胚胎转移至稀释液(DS)中作用3 min，再依次转移至洗涤液1及2(WS1、WS2)中各作用5 min后再将胚胎转移至G2 Plus囊胚培养液(Virtrolife，瑞典)中，置37℃、6%CO2、5%O2环境中继续培养，等待移植。

3.内膜准备及囊胚移植：采用人工或自然周期准备内膜，移植日子宫内膜厚度超过7 mm方可移植；在有经验高年资医师指导下行腹部超声引导下行单囊胚移植。移植后第14日查血HCG，HCG>50 U/L为HCG阳性；移植后28～35 d行B超检查，见孕囊者为临床妊娠；移植3个月后复核持续妊娠和流产。

三、囊胚质量细化评分及囊胚扩张程度分级

1.冷冻囊胚细化评分：我们对Gardner评级后的优质囊胚进行细化评分[1-2]：囊胚发育期数Ⅲ期计1.5分，IV期计2分，V期计2.5分；内细胞团(ICM)评级A级计1.75分，B级计1.25分；滋养层细胞(TE)A级计1.5分，B级计1.0分。将3个得分累加得出胚胎质量得分。

2.复苏囊胚扩张分级：原达到冷冻标准的优质囊胚经过复苏培养2 h后，扩张程度表现出差异，常见有四种状态：扩张程度不足1/2，甚至部分囊胚不扩(我们称之为E1)；扩张程度超过1/2但是非完全扩张，空腔扩张不全，可以见到囊胚和透明带间隙明显(我们称之为E2)；扩张程度完全，囊胚在旋转观察中可见贴近透明带，但是囊胚腔未孵化孵出(我们称之为E3)；扩张程度完全，囊胚在旋转观察中可见贴近透明带，并且囊胚孵化孵出(我们称之为E4)(图1)。

图1 冷冻囊胚复苏2 h后囊腔扩张情况分级

四、观察指标

患者一般资料(患者年龄，内膜转化日子宫内膜厚度，周期数，不孕年限和体重指数(BMI)；不同发育速度(D5、D6)及复苏后囊腔不同扩张程度(E1～E4)囊胚移植的临床妊娠率(临床妊娠例数占总FET周期数的百分比)、孕早期流产率(孕3月内流产周期数占妊娠周期数百分比)、持续妊娠率[统计日(均已妊娠3个月以上)持续妊娠周期数占总FET周期数的百分比]。

五、统计分析

采用SPSS21.0软件(IBM，美国)进行统计学分析。正态分布计量数据均数比较采用t检验或方差分析，计数数据比较采用卡方检验；并采用二分类Logistic回归分析对相关参数对临床妊娠率的影响进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者总体资料

本研究总计纳入190例优质单囊胚FET患者的临床资料。患者平均年龄为(31.61±4.32)岁，不孕年限为(4.18±2.73)年，BMI为(21.35±4.71)kg/m2，平均周期数为(1.31±0.73)，移植日子宫内膜厚度为(10.95±2.39)mm。

囊胚复苏率为100%，临床妊娠率为60.0%，早期流产率为3.7%，持续妊娠率为52.6%。

二、囊胚复苏后不同扩张程度组的妊娠结局

按照复苏2 h后囊胚不同扩张程度分为E1～E4组。不同组别间年龄、不孕年限、BMI、子宫内膜厚度和胚胎质量评分均无统计学差异(P>0.05)；各组间HCG阳性率和临床妊娠率均有统计学差异(P<0.05)，HCG阳性率和临床妊娠率排序相同，依次为E3、E2、E4、E1；各组间持续妊娠率有统计学差异(P<0.05)，从高到低依次为E3、E4、E2、E1；各组间早期流产率有统计学差异(P<0.05)，在E2组达到18.8%，在E3组为7.0%，在E4组为1.9%(表1)。

三、不同发育速度单囊胚FET周期移植结局比较

不同发育速度(D5、D6)优质单囊胚FET周期比较，患者基础数据一般临床妊娠资料(不孕年限、年龄、 BMI、平均周期数、移植日子宫内膜厚度和胚胎质量评分)均无统计学差异(P>0.05)；D5临床妊娠、早期流产和持续妊娠情况均优于D6，但均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表1 复苏囊胚不同扩张程度组基本情况和FET周期结局[(-±s)，n(%)]

表2 不同发育速度囊胚FET周期结局[(-±s)，n(%)]

四、临床妊娠影响因素分析

采用二分类Logistic 回归分析。在校正可能混杂因素后，Ⅲ期及Ⅲ期以上优质冷冻囊胚复苏后扩张程度对于持续妊娠具有显著影响[OR=0.19，95%CI(0.03，1.05)，P=0.037]，其他因素如发育期数、ICM评级、TE评级、内膜厚度、周期数、不孕年限、胚胎总体评分和内膜准备方案均无显著影响(P>0.05)(表3)。

表3 优质单囊胚FET持续妊娠影响因素Logistic分析

讨 论

本研究结果显示，在基础条件保持一致的前提下，复苏的优质冷冻囊胚扩张程度与妊娠结局具有密切关联。各组别间FET周期结局指标(HCG阳性率、临床妊娠率和持续妊娠率)最佳的是E3组，最差是E1组；在HCG阳性率和临床妊娠率中，E2组优于E4组，但是持续妊娠率则刚好相反，主要是E2组流产率远高于E4组(18.8% vs. 1.9%)(详见表1)。综合分析可知，复苏囊胚扩张程度小于1/2的组别(E1)妊娠结局不理想，不完全扩张(包含E1和E2组)囊胚持续妊娠率低于其他组别；培养2 h后，囊胚有无孵出对于持续妊娠率影响不大。

在胚胎选择上，形态学评价是目前最为重要且应用最为广泛的方法。目前，对于囊胚移植的形态学选择主要基于胚胎发育速度、内细胞团(ICM)评级和滋养层(TE)评级[1-2]。最近，Zhao等[3]研究显示，冻融囊胚移植中，囊胚发育速度对临床妊娠率呈现显著影响，而患者年龄、不孕不育原因、胚胎冷冻处理方式、内膜药物准备方式、ICM和TE评分对于临床妊娠率均无显著影响。在胚胎体内发育中，ICM在母体内会发育为胎儿，而TE则发育为母体和胎儿的连接部分，提供营养、免疫、发育和代谢等通道作用[1]。在胚胎选择上，普遍观点是ICM评级优于TE评级[1-2]。同时，早在2011年，Goto等[4]发现在1 488例单囊胚冻融移植中，囊胚发育速度对于妊娠结局影响显著大于ICM/TE评分；2016年Du等[5]也证实囊胚发育速度相较于ICM/TE评分在新鲜或者冻融胚胎移植周期具有更好的预测活产率潜能。本研究采用上述观点，首次对囊胚进行了赋分评价：并且予以同级别的ICM较同级别的TE高0.25分的赋值，IV期囊胚得分高于最优质的ICM评分0.25分(具体评分细节见方法部分)。研究发现：在入组的研究对象中，不同复苏后扩张程度(E1～E4)的优质囊胚得分并无明显差异，其他一般基础资料(女性年龄、不孕年限、体重指数、周期数和移植日子宫内膜厚度)均无明显差异，但是其妊娠结局却显示出统计学差异，我们直观看到原始扩张优质囊胚在复苏后的扩张状态可以有效预测其临床结局。

随后，我们又分析了入组样本不同冷冻日(D5和D6)患者组的基础资料和妊娠结局。结果显示，不同冷冻日囊胚的女性年龄、不孕年限、体重指数、周期数、囊胚质量评分和移植日子宫内膜厚度均无显著差异；D5优质单囊胚的临床妊娠率和持续妊娠率均稍优于D6优质单囊胚，且流产率偏低，但均无显著差异。方媛等[6]研究显示，非优质胚胎囊胚冻融移植周期中，低级别囊胚冻融移植成功率较低，D5囊胚较D6囊胚具有更高的移植成功率。该结论部分支持了我们的结果，但没有揭示优质单囊胚移植后妊娠结局的关键因素。本研究采用优质囊胚为研究对象，减少了胚胎质量差异对妊娠结局的影响。张怡等[7]研究表明，不同时间形成优质的囊胚(D5、D6)，囊胚发育速度对FET周期单囊胚移植结局影响不大；Gardner等[1]在2017年也报道，囊胚发育时期和/或ICM/TE情况并不显著影响单囊胚移植的临床妊娠率；邱乒乒等[8]也发现，囊胚复苏周期移植成功率与囊胚发育天数无关；黎佩怡等[9]2020年也报道，复苏周期单囊胚移植中，对于优质囊胚，内细胞团和滋养层细胞的形态学评分差异对于妊娠结局无显著影响，均可选择用于复苏周期移植；而王雪等[10]研究表明，单囊胚的冻融周期移植时，优先选择D5的优质胚胎。我们的研究与上述多数研究[1，7-9]结果吻合。

最后，我们采用Logistic回归分析探究优质单囊胚FET的关键影响因素。结果显示，冷冻复苏后的胚胎恢复扩张程度是持续妊娠率的显著且独立因素，而与患者年龄、周期数、发育期数、发育速度、ICM评级、TE评级、子宫内膜准备方案、胚胎评分和不孕年限等均无显著关系。这或许与本研究选择了优质单囊胚行FET有关系。同时，诸多的研究表明囊胚扩张程度与早期胚胎定植有密切关系，这些研究表明囊胚扩张与透明带内孵化、HCG介导的子宫内膜的信号传导、粘附和浸润有关联[11-14]。这也从侧面解释了本研究中冷冻复苏后囊胚复苏扩张程度为何相较于胚胎发育速度、TE和ICM具有更强的预测持续妊娠的能力，复苏后胚胎扩张程度一定程度反映了胚胎活性及其移植后发育潜能。夏梦等[15]分析了复苏后IV～VI期囊胚移植的妊娠结局，移植前囊胚腔扩张程度与临床妊娠率及活产率并无显著相关性；通过分析该文献可知，该研究并未对不同扩张时期的影响妊娠结局的基础资料加以分析，未排除胚胎质量、年龄或移植日子宫内膜厚度等差异带来的影响。

伴随囊胚培养体系的完善和培养试剂的优化，现阶段囊胚培养成功率和优胚率逐步提高。后续实验中，我们也可对于部分优质胚胎在冷冻复苏后延长体外培养时间，在不同时间节点收集胚胎培养液成分分析，确定胚胎持续发育的关键因子；同时采用不同培养时间、扩张程度和临床结局的关联分析，可为辅助生殖人工智能技术的完善提供更多可靠参数。此外，本研究为单中心优质单囊胚FET周期研究，今后可增加扩大样本量，实施多中心随机对照试验，评价终点至活产率，进一步评价囊胚复苏后扩张程度作为移植形态学指标的参考价值。

综上所述，优质单囊胚冷冻复苏后囊胚非完全扩张的囊胚妊娠结局欠佳，囊胚复苏扩张程度可以作为单胚胎选择的一个重要参数。