宫颈液基细胞块制备法的对比研究

张雪梅，黄灵泉

广西医科大学第四附属医院病理科，广西 柳州 545005

宫颈液基细胞学检查是目前宫颈病变筛查最常用的方法[1]，其中未能明确意义的非典型鳞状细胞(ASC-US)是最常见的细胞学诊断，也是宫颈细胞学诊断的难点[2-3]。细胞包埋术的出现大大缓解了细胞学诊断的压力，提高了细胞病理诊断的准确性[4]。尤其是胸腹水细胞蜡块的制作，为胸腹水细胞病理诊断及后续相关免疫组织化学及分子病理检测提供了机会，并且制作技术成熟，已广泛用于临床病理诊断。目前对于宫颈细胞蜡块的制作报道较少，不同方法制片质量存在一定差异。本实验拟通过对不同的宫颈细胞蜡块制作方法进行对比研究，探讨不同方法对制片质量的影响，以探索宫颈细胞蜡块制作较为理想的方法，为宫颈细胞病理诊断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 病例资料 收集广西医科大学第四附属医院病理科2017年10月至2018年6月经宫颈液基细胞学检测的剩余标本45例，其中细胞学诊断阳性、阴性、可疑阳性各15 例。每种方法均选取阳性、阴性、可疑阳性标本各5例。

1.2 主要试剂 95%酒精、琼脂、细胞蜡块制备试剂盒(安必平)。

1.3 实验方法

1.3.1 方法1 采用直接取细胞沉渣法。将宫颈液基细胞保存瓶中的剩余标本倒入离心管内，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，往离心管内加入8 mL 95%酒精，2 000 r/min离心10 min，静置4 h后倒去酒精，沉渣聚集成团，将沉渣物取出直接放至包埋纸内包好，按常规石蜡包埋制备蜡块。

1.3.2 方法2 采用琼脂包裹法。(1)将宫颈液基细胞保存瓶中的剩余标本倒入离心管内，2 500 r/min离心5 min，用吸管吸去大部分液体，保留高于沉渣1～2 cm的液体；(2)用10 mL吸管吸取60℃3%琼脂一滴，滴于胃镜小标本包埋盒的小槽内，使其铺满包埋盒底部，并放至冰箱冷冻2 min 使琼脂凝固成形；(3)用吸管反复抽吸将离心管内的沉渣与液体混匀，置于铺满琼脂的包埋盒槽内，放置恒温箱至细胞沉渣平面由凸面转变为凹面；(4)在包埋盒内再次加入琼脂，直至覆盖沉渣表面，将包埋盒置于冰箱冷冻5 min；(5)取出包埋盒内的琼脂以及细胞沉淀物，用包埋纸包好，按常规石蜡包埋制备蜡块。

1.3.3 方法3 采用试剂盒制备法。(1)将宫颈液基细胞保存瓶中的剩余标本倒入离心管内，800 r/min离心5 min，去上清液；(2)滴入1～3滴细胞蜡块制备试剂盒试剂A，震荡，使细胞与试剂A充分混合，800 r/min离心2 min，弃去多余上清液；(3)滴入2～3滴试剂B，静置30 s，轻轻摇晃试管，使细胞团与离心管底部分离，用软吸管将细胞团吸起，转移到包埋纸上，轻压细胞团，使细胞团变得扁平，包埋纸包好后后放入包埋盒中，按常规石蜡包埋制备蜡块。三种细胞蜡块制备完成后均进行常规切片，HE染色，由两位高年资病理诊断医师共同阅片。

2 结果

2.1 细胞蜡块及切片制作效果

2.1.1 肉眼观察 将宫颈液基细胞学检测后的剩余标本离心，使细胞沉渣沉积于离心管底部，沉渣量基本相同(图1A)。利用上述三种方法分别收集细胞沉渣，其中方法1取得的细胞沉渣量相对较少，部分呈浑浊半固体状，较分散，离心管底部仍有少量细胞沉渣不易取出；方法2取得的细胞沉渣基本都平铺于琼脂中央，较集中；方法3取得的细胞沉渣呈白色块状，聚集较紧密(图1B)。三种方法收集的细胞沉渣经脱水包埋切片染色，其中方法1所得HE切片肉眼观细胞沉渣较集中，细胞量相对较少；方法2所得细胞沉渣在切片上较均匀地平铺分布，切面较大，可观察的细胞较多；方法3 所得HE 切片细胞沉渣较集中，细胞量相对较多(图1C)。

2.1.2 显微镜下观察 方法1制备的细胞蜡块切片染色后细胞较集中，呈片状聚集或堆叠，细胞之间不易分散，有时会影响观察；方法2制备的细胞蜡块切片染色后细胞均匀平铺，可观察面较大，仍有部分细胞间分散不彻底，呈片状，细胞之间可见少量淡蓝色琼脂无定型物；方法3 制备的细胞蜡块切片染色后细胞较集中，细胞之间易分散，较均匀平铺，背景干净(图2)。

图1 细胞蜡块及切片肉眼观察

图2 三种细胞蜡块制备法HE切片显微镜下形态

2.2 操作过程及时间 方法1操作步骤简单，实验过程需要4～5 h；方法2 操作步骤较繁琐，且需要提前配置3%琼脂，操作时长约0.5 h；方法3 操作简单，用时约10余min。

3 讨论

宫颈液基细胞学是目前宫颈病变筛查最主要的检测方法，阳性或可疑阳性的病例会分流至宫颈活检以及后续的免疫组化检查。然而，宫颈活检取材局限，对于病变较少的病例容易造成漏诊。细胞蜡块制备技术是对薄层液基细胞学有力的补充，将宫颈液基细胞学检测剩余的标本经离心固定，制作成细胞蜡块，可以连续切片并永久保存，弥补了细胞学标本利用不充分以及活检取材局限的缺点[5]。较多学者对细胞蜡块联合免疫组化检测及分子病理检查进行了研究，提示联合检查可以提高宫颈细胞学诊断的准确率[6-9]。

然而，宫颈液基细胞学检查因其刷取的特点，相对其他脱落细胞标本细胞数量较少，因此对于有限的标本量，提高其利用率是宫颈细胞蜡块制备的关键。本研究采取三种不同方法对细胞沉渣进行收集，拟探讨一种较好的宫颈细胞蜡块制备方法，将其便捷有效地用于宫颈细胞学的诊断中。

直接取细胞沉渣法是较为简单的一种方法，主要步骤为离心和固定，其中固定对于细胞沉渣的转移及取出尤为重要。实验结果显示固定时间过短，则细胞不易聚集，呈浑浊半固态，仍有部分细胞沉渣贴附于试管壁，不易取出，这样制成的细胞蜡块，往往细胞量较少，沉渣利用不充分，与文献报道的结论一致[10]。结果提示，95%酒精固定4 h 能够较好地使细胞聚集成形，便于转移细胞沉渣以及后续的细胞块包埋。其优点：方法简单易行，成本较低；其缺点：制备时间最长，整体流程大于4 h；静置4 h后细胞虽能聚集呈团，但因沉渣位于离心管底部，在吸取沉渣时常导致沉渣碎落，吸管及离心管附着较多细胞，脱水后包埋纸中仍贴附有部分细胞，导致标本的收集效果不理想，标本利用率降低。制片后细胞之间不易分散，容易成片聚集，细胞堆叠严重，影响观察。

琼脂包裹法是文献报道中使用较多的方法，该方法采用小号胃镜标本包埋框进行细胞收集，这样易使细胞集中，在包埋框底部加一层琼脂，使细胞沉渣得到一定的支撑和依托，细胞与琼脂融合后再次加入琼脂，以琼脂为依托，包裹细胞沉渣便于沉渣的取出。本研究发现，采用文献报道[11]中的温箱凝固琼脂法，细胞沉渣容易受固定液挥发时间及琼脂凝固时间的影响而沉积于琼脂中深浅不一，致使细胞在切片时难以处于同一平面；同时实验时间较长。本研究在顾维娜等研究的基础上，采用冰箱冷冻法对琼脂进行凝固，相比较文献中置入温箱凝固琼脂的方法，冰箱冷冻凝固能够使琼脂快速成型，使细胞沉渣平铺于同一层面，同时缩短了琼脂凝固时间。琼脂包裹法的优点：琼脂作为细胞沉渣的支撑物并将细胞包裹于内，使得细胞得到较大程度的利用，制片后细胞均匀平铺，可观察面大；缺点：镜下背景中可见淡蓝色琼脂无定型物存在，有时影响观察，该方法制备时间较长，从离心管中吸取细胞时也有部分细胞残留于吸管内，同时，每次操作均需溶解琼脂，配置的3%琼脂亦不能长期保存，操作步骤繁琐。

试剂盒制备法采用试剂盒AB 试剂，其中试剂A是一种特殊的分散体系，在试剂B的催化作用下其中的胶体颗粒会相互连接，搭成架子，形成空间网状结构，使液体和细胞充满在结构空隙中，将细胞紧密地网在其中，让细胞成团且不破坏结构。该方法在离心试管内加入AB液，使细胞形成团块，避免了转移时离心管及吸管内的细胞残留问题，细胞损失少，且细胞团呈果冻状，易与管壁分离，从而提高标本利用率。其优点：操作简单，用时最短，收集效果最好，缺点：该试剂价格相对昂贵，标本量大时需要的试剂较多，因此该方法更适用于量少且难收集的标本。

综上所述，直接取细胞沉渣法操作简单，成本低，易于推广，但标本利用率不高，制备时间长；琼脂包裹法制片效果良好，但操作步骤繁琐；试剂盒制备法操作简单，用时短，标本利用率高，但其成本较高。前两种方法适合基层医院推广，其中琼脂包裹法更胜一筹。对于经济条件较好的地区，推荐使用试剂盒制备法，大大节约时间和人力，制片效果好。