京尼平对高糖氧化损伤的H9c2细胞的保护作用

师 岩 陈庆友 刘玉宝 宁小美 张春晶 王小龙 李 林 徐 晶 张雪丽

ProtectiveEffectofGenipinonH9c2CellsagainstHighGlucose-inducedInjuryofOxidativeStress.ShiYan,ChenQingyou,LiuYubao,etal.DepartmentofBiochemistry,QiqiharMedicalCollege,Heilongjiang161006,China

AbstractObjectiveTo explore attenuate effects of genipin on high glucose-induced oxidative injury in H9c2 cells.MethodsH9c2 cells were cultured in vitro and divided into four groups. We measured viability of H9c2 exposed to different concentrations of glucose by CCK-8 assay. The oxidative stress-induced early apoptosis of cells were analyzed by AnnexinⅤ/PI flow cytometry. The levels of CK-MB in the supernatant of culture media and the levels of MDA and SOD in the H9c2 cells were determined by colorimetry.ResultsCCK-8 assay results showed that the viability decreased with the 33.3 mmol/L glucose concentration, while the group pretreated with 10μmol/L genipin could increase the viability significantly (P<0.05). Compared with the control group, high glucose could induce cell oxidative stress-induced early apoptosis by AnnexinⅤ/PI flow cytometry, while genipin could inhibit the early apoptosis induced by high glucose significantly(P<0.05). The results showed significant increase of CK-MB and MDA levels and decrease of SOD activity in the high glucose group compared with the control group. However, the high glucose group pretreated with genipin, CK-MB and MDA levels decreased and SOD activity increased significantly compared with the high glucose group(P<0.05).ConclusionGenipin can attenuates significantly high glucose-induced oxidative injury in H9c2.

KeywordsHigh glucose; Genipin; Oxidative injury; H9c2 cells

糖尿病性心肌病，主要发病机制之一是长期高浓度血糖作用下，心肌细胞发生氧化应激损伤，产生大量氧自由基及活性氧，会直接损伤心肌细胞，细胞凋亡增加，心脏功能会发生障碍，严重可能危及患者生命[1，2]。利用有效的抗氧剂能对糖尿病性心肌病具有很好的保护作用。京尼平是从天然植物栀子花和果实中提取的强抗氧化剂，小剂量应用天然无毒，易被机体细胞吸收[3]。京尼平是线粒体内膜解偶连蛋白(UCP2)的特异性阻断剂，能防治多种发病机制与氧化应激损伤有关的疾病，例如缺血再灌注引起的心肌细胞氧化应激损伤具有明显抑制作用，能有效保护肝细胞氧化应激损伤，减轻脊髓小脑神经细胞氧化应激损伤等作用[4～8]。但京尼平在糖尿病心肌细胞损伤中发挥作用的报道不多，本研究建立高糖细胞氧化损伤模型，研究京尼平在高糖导致的心肌细胞氧化损伤中的作用。

材料与方法

1.实验材料：大鼠心肌细胞系H9c2(编号：GNR5，上海中国科学院细胞库)；京尼平(美国Cayman公司)；DMEM和特级胎牛血清(美国Gibco公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、肌酸激酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；AnnexinⅤ/PI细胞凋亡检测试剂盒 (杭州联科生物技术有限公司)。

2.细胞培养和分组：(1)37℃、5%CO2细胞培养箱常规培养大鼠心肌细胞系H9c2：DMEM培养液，含10%胎牛血清。(2)对数期生长细胞分为4组：①正常糖对照组(NC组)：5.6mmol/L葡萄糖浓度;②正常糖+京尼平组(NC+GEN组)：正常糖中加10μmol/L浓度京尼平;③高糖损伤组(HG组)：33.3mmol/L葡萄糖浓度;④高浓度葡萄糖+京尼平组(HG+GEN组)：高浓度糖中加10μmol/L浓度京尼平。

3.CCK-8 法检测各组H9c2心肌细胞存活率：对数期生长细胞，分组培养48h，胰酶消化后，细胞悬液以3×103个/孔的密度接种于96孔培养板，每组设复孔5个，弃上清，每孔加100μl完全培养基后，再加10μl CCK-8试剂，轻缓的晃动培养板，使试剂和培养基混匀，空白对照不加细胞悬液只加110μl CCK-8试剂，再置培养箱中继续孵育2h，在450nm波长处检测吸光度(A)值，再换算成细胞存活率比较。

4.细胞体外培养:使细胞同步于G0期，不同因素分组培养48h后，按试剂盒说明书操作，收集细胞悬液于离心管中,1500r/min,离心5min,弃上清液,用1×Binding buffer将细胞调整至1×106个/毫升浓度,取400μl细胞悬液转至5ml 流式专用试管,分别加入FITC标记的5μl Annexin-Ⅴ，再加入10μl PI溶液，阴性对照不加AnnexinⅤ-FITC及PI，混匀,避光孵育5min后快速检测。

5.H9c2细胞:用0.25%胰酶、0.02% EDTA消化，以(1.5～2.0)×105个/毫升接种于100mm培养板中，常规培养24h后。细胞氧化应激损伤指标按试剂盒说明书操作，各组不同条件培养48h后，相应波长处测定各组细胞吸光度(A)值，再换算成细胞培养上清液中CK-MB含量和细胞内MDA含量、SOD活力，比较各组细胞氧化应激水平。

结 果

1.CCK-8 法检测不同浓度的京尼平对H9c2细胞存活率的影响：正常糖细胞即对照组，5μmol/L和10μmol/L京尼平加入正常糖后的细胞存活率变化较小，差异无统计学意义。20μmol/L和40μmol/L京尼平浓度加入时，细胞存活率明显逐渐下降(P<0.05，图1)，对正常糖细胞存活率低于50%，影响较大，故用10μmol/L京尼平为应用浓度。

图1 CCK-8 法检测正常糖条件下加入不同浓度京尼平对H9c2细胞存活率的影响与0μmol/L组比较，*P<0.05

2.CCK-8 法检测京尼平对高糖损伤H9c2心肌细胞的细胞存活率影响：根据前期研究，选择33.3mmol/L高浓度葡萄糖作用48h诱导氧化应激心肌细胞损伤模型，10μmol/L京尼平对正常糖细胞存活率影响较小，作为作用浓度。CCK-8 法检测细胞存活率，高糖损伤组(HG组)与正常糖对照组(NC组)比较显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；京尼平保护组(HG+GEN组)与高糖损伤组(HG组)比较，细胞存活率显著提高，差异有统计学意义(P<0.05，图2)，10μmol/L京尼平对高糖损伤的细胞可提高细胞存活率。

图2 CCK-8 法检测10μmol/L京尼平对H9c2细胞存活率的影响与NC组比较，*P<0.05；与HG组比较，#P<0.05

3.AnnexinⅤ/PI流式细胞仪法检测细胞凋亡： AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞仪检测, 在双变量FCM 的散点图上表示细胞情况。左上象限(UL)：细胞碎片和坏死细胞；左下象限(LL)：正常细胞；右下象限(LR)：早期凋亡细胞；右上象限(UR)：晚期凋亡和少量坏死细胞(图3)。比较各组LR象限的细胞早期凋亡比率，NC+GEN组的细胞早期凋亡细胞(图3B) 与NC组(图3A)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HG组细胞与NC组比较，早期凋亡明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，图3C)。HG+GEN组与HG组比较早期凋亡率下降，差异有统计学意义(P<0.05，图3D)。

图3 AnnexinⅤ/PI双标记流式细胞仪检测各组细胞散点图A.NC组(5.6mmol/L 葡萄糖); B.NC+GEN组(5.6mmol/L 葡萄糖+10μmol/L 京尼平); C.HG组 (33.3mmol/L 葡萄糖); D.HG+GEN组(33.3mmol/L 葡萄糖+10μmol/L 京尼平)；与NC组比较，*P<0.05；与HG组比较，#P<0.05

4.细胞培养上清液中CK-MB水平和细胞内MDA、SOD活性的测定：细胞培养上清液中CK-MB水平，反映心肌细胞的氧化应激损伤程度。高糖组(HG组)与对照组(NC)比较，CK-MB、MDA 含量明显增高，SOD 含量显著下降(P<0.05)。但给予10μmol/L京尼平后，与HG组比较，其CK-MB、MDA含量明显下降，SOD 含量显著上升(P<0.05，表1)。

表1 各组CK-MB、MDA、SOD 含量的比较

讨 论

糖尿病患者血糖长期偏高状态，会引起心肌细胞氧化应激损伤已经得到证实，有效保护心肌细胞免受或减少氧化应激损伤成为研究的热点[9,10]。京尼平是传统中药栀子、杜仲等植物中提取的有效抗氧化剂，是一种特异的羟基清除剂，有效清除活性氧和自由基，具有多重抗氧化应激和保护线粒体功能的作用，已经证明在防治糖尿病并发症相关的神经系统损害、视网膜病变、肾病及心血管系统疾病等多种病症中，可以发挥抗氧化应激保护作用[11～15]。在前期研究基础上，进一步研究京尼平在糖尿病心肌病中的作用[16]。

根据相关文献报道，实验中建立了33.3mmol/L高糖诱导的心肌细胞损伤模型，CCK-8法测定多种不同浓度京尼平对H9c2细胞存活率的影响，10μmol/L京尼平对正常糖组的细胞存活率没有影响，却能使高糖条件心肌细胞存活率提高，说明京尼平能一定程度的保护高糖环境的心肌细胞，减少损伤的程度[17,18]。机体细胞损伤会使细胞凋亡增加，细胞凋亡状态可以直接反应细胞损伤的程度，二者密切相关，抑制细胞早期凋亡，细胞损伤能可逆性改变，AnnexinⅤ/PI流式细胞仪法检测10μmol/L京尼平减少了高糖环境的早期凋亡细胞率，进一步说明京尼平对高糖环境心肌细胞损伤有很好的抑制作用。

高糖环境导致心肌细胞抗氧化应激的酶系统破坏，氧化应激状态的细胞将产生大量自由基，导致氧化还原稳态平衡失调，脂质过氧化也会损伤细胞的机能，增加心肌细胞凋亡和损伤的程度。细胞损伤时，细胞内酶CK-MB会大量释放，CK-MB是心肌细胞内含量较多的肌酸激酶的一种同工酶，心肌细胞损伤早期就会大量释放出来，测定细胞培养上清液中CK-MB活性可反映细胞损伤程度，含量的增加是细胞不可逆损伤的标志[19]。MDA是细胞脂质过氧化降解产物，其含量越高说明脂质过氧化的程度越高，从而反映细胞受过氧化损伤的程度[20]。SOD是心肌细胞抗氧化系统中重要的抗氧化应激酶，其活性的高低可反映出细胞清除氧自由基的能力，直接反映着细胞抗氧化应激的能力[21]。检测细胞培养上清液中CK-MB，细胞内MDA、SOD的含量，高糖组与对照组比较，CK-MB、MDA含量明显增高，SOD含量显著下降，而京尼平保护组与高糖组比较，CK-MB、MDA含量明显下降，SOD含量显著升高，这说明一定浓度的京尼平是通过抗氧化系统的作用来保护高糖环境的心肌细胞，减少氧化应激损伤，其作用机制与减少氧化应激产物的释放，平衡抗氧化应激酶系统，抑制线粒体损伤途径和内质网通路应激有关，有利于损伤细胞的自我修复，进而减轻糖尿病心肌细胞损伤，与线粒体和内质网功能变化相关的一系列酶蛋白的调控作用及其抗氧化机制将进一步研究，在有效防治糖尿病心肌病方面发挥作用。