健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血模型的止血作用评价

王 珺 王 博 张 蕴 周郁鸿 徐懿乔 张 勇 陈信义

HemostaticEffectofJianpiyiqiShexueGranulesonZebrafishIntestinalHemorrhageMode.WangJun,WangBo,ZhangYun,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity(ZhejiangProvincialHospitalofTCM),Zhejiang310006,China

AbstractObjectiveTo establish a model of thrombocytopenia in zebrafish complicated with intestinal bleeding, and to observe the hemostatic effect of jianpi yiqi granules on intestinal bleeding in zebrafish, so as to provide a basis for clinical promotion and application.MethodsAfter measuring the maximum lethal drug concentration, simvastatin was used to induce a zebrafish intestinal hemorrhage model, and the three different doses of jianpi yiqi granules 56, 167 and 500μg/ml were determined as the intervention drugs. The hemostatic effect of jianpi yiqi granules on the intestinal hemorrhage of zebrafish was evaluated with the incidence of zebrafish intestinal hemorrhage, which also can reduce the intestinal bleeding and the hemostatic rate.ResultsThe zebrafish intestinal hemorrhage rate in the model control group was 70%. After intervention with Jianpiyiqi blood-taking particles 56, 167 and 500μg/ml, the zebrafish intestinal bleeding rates were 37%, 40% and 80%, respectively. Among them, the two dose groups of 56μg/ml and 167μg/ml were statistically significant compared with the model control group (P<0.05). The results showed that the concentration of small dose of jianpi yiqi granules could significantly reduce the incidence of intestinal bleeding in zebrafish. The number of platelets in the intestinal tract of zebrafish in the model control group was 16.60, and the number of platelets in the intestinal tract of zebrafish was 7.60, 8.00 and 15.50 respectively, after the intervention with concentrations of 56, 167 and 500μg/ml, which was statistically significant compared with the model control group (P<0.01, 0.01 and 0.05). Intestinal hemostasis was 54%, 52% and 7%, respectively. The results showed that small dose of jianpi yiqi granules had obvious hemostatic effect on intestinal bleeding of zebrafish.ConclusionSmall dose (56μg/ml) and medium dose (167μg/ml) of jianpi yiqi granules can not only significantly reduce the intestinal bleeding rate of zebrafish, but also have good hemostatic effect.

KeywordsImmune thrombocytopenia; Jianpi yiqi granules； Zebrafish intestinal bleeding

ITP是临床最常见的出血性疾病，多数病例可见多部位出血，如皮肤瘀斑、瘀点或黏膜出血，严重者可见内脏出血，如尿血、便血等[1]。基于审证求因与辨证施治理论，急性ITP多见热邪导致的“热迫血行”证候，宜“清热解毒凉血止血”治疗[2]；慢性ITP多由脾气虚弱导致“气不摄血”证候，宜“健脾益气摄血”治疗[3]。课题组在前期临床研究中发现，具有“健脾益气摄血”功效的健脾益气摄血颗粒能够明显改善ITP患者临床症状，提升外周血小板计数，并有较好的止血效果[4]。基础研究也证实，健脾益气摄血颗粒可以明显降低出血模型斑马鱼脑、肝脏、心脏出血发生率[5，6]。本研究采用辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血模型，并对健脾益气摄血颗粒止血效果进行了评价。

材料与方法

1.实验动物：野生型AB品系斑马鱼以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后2天(2dpf)和4天(4dpf)，用于肠道出血模型建立与肠道出血效果评价。血小板荧光斑马鱼Tg(-6.0itga2b:EGFP)购自国家斑马鱼资源中心，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为4dpf，主要用于肠道止血作用评价。实验完成后用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。斑马鱼设备和实验符合AAALAC要求(IACUC许可证号：001458)。

2.药物：辛伐他汀：斑马鱼肠道出血模型诱导剂，白色粉末，批号为404-520-2，购自日本TCI公司，用100%DMSO配制实验用储备液，-20℃保存备用。健脾益气摄血颗粒：健脾益气摄血方配方颗粒(黄芪、党参、茯苓、白术、阿胶、茜草、炙甘草)，由北京康仁堂药物有限公司制备并提供。制备方法为单味中药水提，喷雾干燥后，混合。临用前用斑马鱼饲养水配制成100mg/ml母液，现配现用。

3.试剂与仪器：甲基纤维素(美国Sigma公司)，白色粉末。邻联茴香胺[批号MKBX3619V，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]。Trizol购自美国Invitrogen 公司；DEPC处理水购自上海生工公司。氯化钠、异丙醇(分析纯)、氯仿、无水乙醇等购自杭州双天生物技术有限公司。精密电子天平(CP214，美国OHAUS公司)；解剖显微镜(SZX7，日本Olympus公司)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，日本Nikon公司)；显微注射仪(IM-300，日本Narishige公司)。

4.药物最大非致死浓度测定：随机选取180尾2dpf野生型AB品系斑马鱼，设正常饲养对照组、健脾益气摄血颗粒不同浓度组，每组30尾斑马鱼。在实验过程中，每天观察并记录斑马鱼死亡情况，并移除死亡的斑马鱼。最后统计各组的斑马鱼死亡数量，得到各实验药物的最大非致死浓度(maximum non-lethal concentration，MNLC)。

5.建立斑马鱼肠道出血模型：基于野生型AB品系斑马鱼第1次肠道收缩发生在4dpf，进食从5dpf开始的生长规律。因此，肠道出血模型造模选择4dpf阶段。因首次在国内建立斑马鱼肠道出血模型，探索性选定辛伐他汀诱导浓度为1、2、4、6和8μmol/L，诱导时间设置为24h，用邻联茴香胺染色(含 0.6mg/ml 邻联茴香胺、0.01mol/L 醋酸钠、0.65% H2O2、40% 乙醇，染色15min)，并在解剖显微镜下观察和记录每组斑马鱼肠道出血数量(n)，以出血发生率评价模型是否成功。斑马鱼肠道出血发生率计算公式：出血发生率(%)=(肠道出血斑马鱼数/斑马鱼总数)×100%。

6.肠道出血发生率计算：取4dpf野生型AB品系斑马鱼置于6孔板中，分别给予健脾益气摄血颗粒不同浓度水溶液。同时，设置正常饲养对照组和模型对照组。每孔斑马鱼尾数为30尾，以不同浓度辛伐他汀为诱导剂，每孔容量为3ml，给药24h后，在解剖显微镜下观察和记录每个实验组肠道出血的斑马鱼数量(n)，以出血发生率为统计值，按照斑马鱼肠道出血发生率计算公式，评价健脾益气摄血颗粒减少斑马鱼肠道出血发生率疗效。

7.肠道出血止血率计算：随机选取4dpf血小板荧光斑马鱼Tg(-6.0itga2b:EGFP)置于6孔板中，分别给予健脾益气摄血颗粒不同浓度水溶液。同时，设置正常饲养对照组和模型对照组，每孔斑马鱼尾数为30尾，每孔容量为3ml，给药24h后，实验各组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下，观察肠道内血小板聚集情况，拍照并保存图片；利用尼康NIS-ElementsD 3.10高级图像处理软件进行图像分析，对每尾斑马鱼逐一计数肠道内血小板个数(n)，以肠道内血小板计数统计结果评价健脾益气摄血颗粒的肠道止血效果。肠道止血效果计算公式：斑马鱼肠道止血率(%)=[(模型对照组肠道内血小板计数-实验组肠道内血小板个数)/模型对照组肠道内血小板计数]×100%。

8.统计学方法：采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，肠道出血发生率用Fisher′s确切检验进行统计学分析，肠道止血效果用方差分析和Dunnett′sT检验分析结果，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.药物最大非致死浓度测定：参照既往实验结果的药物最大致死浓度，并经过反复实验探索，最后确定健脾益气摄血颗粒实验浓度设为125、250、500、1000和2000μg/ml，在实验过程中观察斑马鱼死亡尾数，根据死亡尾数确定药物最大非致死浓度，详见表1。健脾益气摄血颗粒2000μg/ml和1000μg/ml两个浓度组均导致30/30尾斑马鱼死亡，死亡率为100%。其余各组和正常饲养对照组比较，无明显毒性表型。因此，确定健脾益气摄血颗粒对斑马鱼的MNLC为500μg/ml。在随后的实验中按照最大非致死药物浓度作为递减实验剂量，即56、167和500μg/ml。

表1 健脾益气摄血颗粒不同浓度下斑马鱼死亡数量

2.斑马鱼出血模型探索：随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼180尾置于6孔板中，分别给予辛伐他汀1、2、4、6和8μmol/L浓度的水溶液。同时，设置正常饲养对照组，每孔斑马鱼尾数为30尾，每孔容量为3ml，给药24h后，用邻联茴香胺染色后，在解剖显微镜下观察和记录每个实验组肠道出血的斑马鱼数量(n)，并依据公式计算出血发生率，评价建模是否成功，详见表2、图1。根据造模结果，以出血量最大的辛伐他汀诱导斑马鱼出血剂量，取中间数值，确定辛伐他汀6μmol/L浓度为造模剂量浓度。

表2 不同浓度辛伐他汀处理24h后斑马鱼肠道出血发生率

图1 辛伐他汀不同浓度斑马鱼出血表型图

3.肠道出血减少率统计：随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼150尾于6孔板中，分别给予健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度。同时，设置正常饲养对照组和模型对照组。每孔斑马鱼尾数为30尾，每孔容量为3ml，辛伐他汀浓度为6μmol/L，给药24h后，在解剖显微镜下观察和记录每个实验组肠道出血的斑马鱼数量(n)，以出血发生率评价健脾益气摄血颗粒减少出血发生效果，详见表3、图2。模型对照组斑马鱼肠道出血发生率为70%，表明模型建立成功。经健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度干预后，斑马鱼肠道出血发生率分别为37%、40%和80%。其中，健脾益气摄血颗粒56、167μg/ml两个剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 健脾益气摄血颗粒处理后斑马鱼肠道出血发生率

图2 健脾益气摄血颗粒处理后斑马鱼肠道出血表型图绿色虚线区域为斑马鱼肠道；绿色箭头指向肠道出血部位

4.健脾益气摄血颗粒止血疗效统计：随机选取4dpf血小板荧光斑马鱼150尾于6孔板中，分别给予健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml剂量浓度水溶液。同时，设置正常饲养对照组和模型对照组，每孔斑马鱼尾数为30尾，每孔容量为3ml，给药24h后，实验各组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下，观察肠道内血小板聚集情况、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，对每尾斑马鱼逐一计数肠道内血小板计数(n)，以肠道内血小板计数的统计结果，评价健脾益气摄血颗粒的肠道止血效果，详见表4、图3。各实验组斑马鱼均未出现死亡。模型对照组斑马鱼肠道内血小板计数为16.60个，与正常饲养对照组(2.20个)比较，差异有统计学意义(P=0.000)。模型建立成功。以健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度干预后，斑马鱼肠道内血小板计数与模型对照组比较，差异有统计学意义(P分别为<0.01、0.01、0.05)。肠道止血率分别为54%、52%和7%(表4)。

表4 健脾益气摄血颗粒处理后斑马鱼肠道止血作用

图3 健脾益气摄血颗粒处理后肠道血小板聚集表型图黄色虚线区域为定量分析部位

讨 论

中医认为脾具有“统血”功能，且有“脾为后天之本，气血生化之源”之称[7]。通过临床观察与文献分析，免疫性血小板减少症，尤其是慢性患者“脾不统血证”是临床最常见的证候类型，而“健脾益气摄血法”能够针对慢性免疫性血小板减少症病机与证候治疗[8]。

免疫性血小板减少症主要临床表现除外周血血小板计数减少外，多部位不同程度出血是临床最常见症状。前期基础研究证实，“健脾益气摄血颗粒”对不同浓度的辛伐他汀在不同时间诱导的斑马鱼脑、肝脏、心脏出血具有良好的止血效果[9]。基于这些研究结果，笔者试图探索辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血模型，并以健脾益气摄血颗粒为干预药物，观察其对斑马鱼肠道出血的止血疗效。研究结果表明，模型对照组斑马鱼肠道出血发生率为70%，经健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度干预后，斑马鱼肠道出血发生率分别为37%、40%和80%。其中，健脾益气摄血颗粒56、167μg/ml两个剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明健脾益气摄血颗粒中小剂量在浓度可明显减少斑马鱼肠道出血的发生率。模型对照组斑马鱼肠道内血小板计数为16.60个，经健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度干预后，斑马鱼肠道内血小板计数分别为7.60、8.00和15.50个，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P分别为<0.01、0.01、0.05)。肠道止血作用分别为54%、52%和7%。表明健脾益气摄血颗粒中小剂量对斑马鱼肠道出血具有明显的止血效果。

对于上述研究结果，有两个问题需要解释。首先，由于观察辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血情况较为困难。邻联茴香胺主要对血红蛋白进行着色，因此是反映红细胞分布的指标，因此选择邻联茴香胺来观察肠道出血情况。笔者基于血小板止血的生理特点，选用转基因血小板荧光斑马鱼Tg(-6.0itga2b:EGFP)为模式动物，以肠道出血部位血小板聚集现象判断止血效果(血小板在出血部位聚集，有利于出血部位止血)。这一方法在国内尚属首次，可能存在着一定的局限性，有待于进一步探究。其次，在模型对照组和药物组中观察到斑马鱼肝脏也有明显的出血，而且肝脏中有大量的血小板聚集。这一现象表明健脾益气摄血颗粒并未引起血小板生成减少，而是对肠道出血有止血疗效。健脾益气摄血颗粒小剂量(56μg/ml)与中剂量(167μg/ml)不但能够明显减少斑马鱼肠道出血率，也有良好的止血疗效。但大剂量(500μg/ml)没有明显的止血效果，其可能的解释是适当剂量(中小剂量)的健脾益气摄血颗粒具有止血效果，而大剂量可能是由于中药多成分、多靶点而出现的脱靶效应，但这一解释并没有得到临床研究数据的证实，需要进行不同剂量的临床疗效探索性研究，进而为临床合理用药提供依据。