血清可溶性间皮素相关蛋白早期诊断大鼠恶性胸膜间皮瘤的实验研究

江 杰 文 亮 吴 莉 谢晓洁 赵 雯 韩 丹

ExperimentalStudyonDiagnosisofRatsMalignantPleuralMesotheliomawithSerumSolubleMesothelin-relatedPeptides.JiangJie,WenLiang,WuLi,etal.MedicalImagingDepartment,TheFirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Yunnan650032,China

AbstractObjectiveTo investigate the value on early diagnosis of experimental rats malignant pleural mesothelioma according to the serum level of soluble mesothelin-related peptides(SMRP), providing theoretical basis and experimental basis for early screening high-risk groups.MethodsThe expression of MPM SMRP in rats was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the differences in the SMRP expression were analyzed in different tumour stages, pathological types and the degree of histological differentiation. The ROC curve was used to obtain the diagnostic efficiency of early diagnosis of MPM.ResultsThere were statistically significant differences in the SMRP expression in MPM different stages and degrees of differentiation (P<0.05). The higher the stage, the higher the expression of SMRP. The lower the degree of differentiation, the higher the SMRP expression. However, there was no significant difference in expression among different pathological types (P>0.05). The AUC value of SMRP for T1, T2, T3, T4were 0.83, 0.86, 0.92, 0.85, the sensitivity and specificity were 100.0%, 88.2%, 100.0%, 85.7%, 71.4%, 100.0%, 87.5%, 100.0%, respectively, and the diagnostic threshold was 1.90, 4.53, 8.73, 11.97mmol/ml. Moreover, the AUC value of SMRP for N1, N2, N3were 0.59, 0.84, 0.92, respectively, and the sensitivity and specificity were 100.0%, 100.0%, 47.1%, 100.0%, 64.0%, 100.0%, respectively. The AUC value of SMRP for M1were 0.88, and the sensitivity and specificity were 75.0%, 100.0%, respectively.ConclusionSMRP can be used as an important biochemical indicator for screening of high-risk population of MPM.

KeywordsMesothelium；Soluble mesothelin-related peptides；Mesothelioma；Malignant pleural mesothelioma

恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)是来源于浆膜间皮细胞的少见高度恶性肿瘤,早期常无任何临床症状及体征，出现异常时多处于肿瘤中晚期，严重影响患者生存质量及预后，如何早期诊断MPM是业界研究的热点[1，2]。影像学检查是MPM诊断及鉴别诊断的重要手段，尤其是高分辨率CT检查常作为首选检查，但早期肿瘤CT检查常表现正常或难以与其他病变鉴别[3]。如何寻求一种更为敏感的生物学标志物为早期诊断提供信息成为新的研究方向。间皮素是一种重要的标志物，在胸膜间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌中存在高表达[4～7]。目前研究主要集中在卵巢癌，对于胸膜间皮瘤研究较少，并且部分研究是分析胸腔积液、肿瘤组织内的间皮素表达情况，血清研究较少，国内未见相关报道，而血清最容易获取，具有临床可操作性。因此本研究通过ELISA方法检测大鼠MPM 间皮素表达情况，为早期诊断MPM提供理论依据及实验基础。

材料与方法

1.实验对象: 100只SD大鼠，雌雄各50只，购自昆明医科大学动物实验中心，实验动物许可证编号：SYXK(滇) K2015-0002。采用胸膜腔闭式注射青石棉纤维混悬液诱发MPM[3]。共获得MPM 72例，其中上皮型21例(29.2%)，肉瘤型37例(51.4%)，混合型14例(19.4%)。根据国际肺癌研究协会最新TNM分期标准[8]：T1期12例，T2期22例，T3期30例，T4期8例；N0期 49例，N1期 15例，N2期8例；M0期65例，M1期7例。临床分期[4]：早期18例，中期25例，晚期7例。分化程度：低分化45例，高分化27例。

2.实验方法: 采用ELISA法测定血清SMRP 浓度，SMRP检测试剂盒及标准品购自上海酶联生物科技有限公司。酶标仪：Molecular PECTRAMAX190(美国Molecular Devices公司)。抽取大鼠尾静脉血1ml，室温静置凝固后，离心20min，取上清液待测。采用双抗体ELISA法，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，使用ELISA calc软件根据标准品浓度和A值做出标准曲线并计算回归方程，根据所得回归方程即可算出待测样本中SMRP的含量。分析不同分期、不同病理类型、不同分化程度MPM的SMRP表达差异。

结 果

1.不同分期MPM的血清SMRP表达: 不同分期MPM的血清SMRP表达差异比较采用t或F检验，差异有统计学意义(P<0.05)。随着分期增高，SMRP表达量增加(表1，图1)。

表1 不同TNM分期SMRP表达差异

图1 MPM不同TNM分期的SMRP表达柱形图A.T分期；B. N分期；C. M分期

2.不同病理类型、不同分化程度MPM的SMRP表达: 72例MPM中,上皮型21例，肉瘤型37例，混合型14例，不同病理类型的相同TNM分期比较，差异无统计学意义(P>0.05)。低分化45例，高分化27例，SMRP表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，低分化组平均SMRP表达量(11.47±2.35mmol/ml)明显高于高分化组(6.29±1.73mmol/ml)。

3. MPM临床分期中SMRP表达差异比较: MPM不同临床分期SMRP的表达量为早期3.65±1.05mmol/ml,中期7.52±3.36mmol/ml，晚期13.57±1.13mmol/ml，比较采用方差分析，两两比较则用LSD检验比较，差异有统计学意义(F=341.63，P<0.05)，MPM越早期，SMRP表达量越低。

4.SMRP对不同分期MPM的诊断效能: SMRP对MPM T、N、M分期比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对MPM T1期ROC曲线下AUC=0.83，最佳临界值是1.90mmol/ml，敏感度为100.0%，特异性为88.2%；对T2期ROC曲线下AUC=0.86，最佳临界值是4.53mmol/ml，敏感度为100.0%，特异性为85.7%；对T3期ROC曲线下AUC=0.92，最佳临界值是8.73mmol/ml，敏感度为71.4%，特异性为100.0%；对T4期ROC曲线下AUC=0.85，最佳临界值是11.97mmol/ml，敏感度为87.5%，特异性为100.0%。对N0期ROC曲线下AUC=0.59，敏感度为100.0%，特异性为100.0%；对N1期ROC曲线下AUC=0.84，敏感度为47.1%，特异性为100.0%；对N2期ROC曲线下AUC=0.92，敏感度为64.0%，特异性为100.0%。对M1期ROC曲线下AUC=0.88，敏感度为75.0%，特异性为100.0% (表2)。

表2 SMRP对不同MPM分期的诊断价值

讨 论

恶性胸膜间皮瘤具有早期不易诊断、恶性程度及病死率高、治疗效果不佳、患者生存质量及预后差等特点。肿瘤具体发病机制尚未详细阐明，流行病学研究发现，MPM的主要致病因素是石棉暴露，而石棉潜伏期很长，可达20～40年，患者早期一般无任何临床症状，出现咳嗽、咳痰、胸闷、胸腔积液等肿瘤多属中晚期，此时预后极差，尚无有效的治疗方式[9]。有研究统计肿瘤处于中晚期对提高患者生存期无明显价值，中位生存率约为9～14个月[10]。而早期诊断、治疗MPM可明显提高患者的生存期，并可明显改善生存质量及预后。因此对有石棉暴露史的高危人群进行早期筛查、诊断具有重要的临床价值。恶性胸膜间皮瘤的TNM分期对于分析肿瘤诊断、治疗、预后具有重要指导价值，术前临床分期以CT检查作为参考，但早期肿瘤CT常表现正常，对早期诊断价值不大。因此如何提高CT检查阴性表现、无法鉴别的早期MPM是业界面临的最大挑战。随着生物技术的发展，通过检测分子生物学标志物可能为早期诊断MPM提供新的思路。

目前非侵入性检测分子标志物早期诊断MPM是研究的热点，其中间皮素是目前研究最广泛的生物学标志物之一，也是被食品药物管理局认可的用于诊断MPM的唯一生物学标志物[5]。人类间皮素基因，也被称为可溶性间皮素相关蛋白，是一种仅表达在间皮细胞的肿瘤细胞表面抗原，通过激活NF-κB途径促进肿瘤细胞存活、增殖，导致白介素- 6水平升高。目前研究认为间皮素可能与肿瘤发生形成、转移等多个环节有关，与肿瘤分期及肿瘤负荷有关，可作为一种预后指标、评价病变进展及对治疗的反应[11～15]。但在对MPM中间皮素表达的研究中，还存在不少争议，有研究检测胸腔积液、肿瘤组织内间皮素表达情况，但MPM患者出现胸腔积液多属中晚期，所以分析胸腔积液的SMRP对早期诊断MPM临床意义可能不大，检测肿瘤组织内间皮素表达对术前诊断意义也不大。也有研究认为SMRP与MPM进展、总生存率之间没有相关性，但也有研究证明SMRP水平与总体生存年限呈负相关[16]。因此以SMRP表达水平来分析MPM早期诊断、评估进展及预后需要更多样本、更标准化的研究进一步分析。

本研究以青石棉诱导大鼠MPM生成，首次采用MPM动物模型进行研究，对肿瘤不同分期、不同病理类型、不同分化程度的SMRP表达差异进行系统研究。通过研究发现，不同分期MPM的SMRP表达具有明显差异，在T、N、M分期分别比较，SMRP差异均有统计学意义，认为SMRP表达可反映出肿瘤分期，进一步证实可能参与肿瘤生长、转移等过程，可为早期诊断、靶向治疗等提供理论依据。随着肿瘤分期越高，SMRP表达量越高，通过检测血清SMRP的表达，对有石棉暴露史的高危人群可进行早期筛查、诊断，具有重要临床价值。通过ROC曲线，得出SMRP早期诊断MPM的参考阈值，这是首次提出具体诊断MPM分期的量化指标，具有重要临床价值。分析SMRP表达与病理类型的关系，发现不同病理类型的MPM SMRP的表达量比较差异无统计学意义，说明SMRP表达与病理类型无关，这与之前研究的结果不同，推测可能原因是样本量不足影响，还需要更多的研究来证实。此外分析不同分化程度的MPM SMRP表达比较，差异有统计学意义，低分化MPM的 SMRP表达高，分化程度代表肿瘤细胞的异质性，与正常胸膜细胞之间的差异越大，恶性程度也越高，说明SMRP表达可间接反映MPM的恶性程度，同时也可能提示根据SMRP表达情况判断预后具有可行性。但本研究是针对大鼠MPM，其研究结果尚不能用于人类MPM，下一步将对MPM患者血清中的SMRP表达进行分析。

综上所述，SMRP可反映肿瘤分期，根据血清SMRP表达量可判断MPM分期，为具有石棉暴露史的高危人群早期筛查、诊断MPM提供理论依据及实验基础。