M2型巨噬细胞与弥漫性大B细胞淋巴瘤预后的研究进展

李捷凯 周永明

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是世界范围内最常见的非霍奇金淋巴瘤类型，约占不同地理区域所有病例的30%～40%[1]。DLBCL患者的标准疗法是利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(R-CHOP)方案，使用该方案约60%～70%的DLBCL患者可以治愈，但仍有部分患者会复发，甚至存在少许患者对R-CHOP治疗无效的现象。因此对于弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后及生存状况等相关研究一直是抗肿瘤研究的重点之一。肿瘤相关的微环境在不同类型肿瘤的发生、发展中起着至关重要的作用，肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的主要成分，它与弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的临床状况和生存状况有关，巨噬细胞在体内主要分为M1型(主要表达CD68和HLA-DR)和M2型(同时表达CD68和CD163)，前者称经典活化的巨噬细胞，起到抑制肿瘤生长的作用；而后者称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，则通过促进血管增生，协助肿瘤转移和免疫抑制来促使肿瘤细胞的生长和耐药性[2]。有研究发现即使在利妥昔单抗时代，M2型巨噬细胞数量增加也与DLBCL患者的预后密切相关[3]。本文就M2型巨噬细胞在细胞外基质、促进血管增生、影响免疫微环境等方面影响弥漫性大B细胞淋巴瘤预后的相关研究进展做一综述。

一、重塑细胞外基质

1.Legumain：Legumain是一种天冬酰胺基内肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶C13家族中的一员[4]。越来越多的数据已经证明了豆荚蛋白在多种肿瘤类型中的表达，提示其在肿瘤进展中的作用，尤其是对细胞外基质有着调节作用。研究发现，TAMs表达大量的豆荚蛋白， 一种抗豆荚蛋白的疫苗或抑制剂可显著消除TAMs，从而抑制鼠类肿瘤模型中的肿瘤生长和转移[5]。Shen 等[6]在OCI-Ly3异种移植小鼠模型研究中通过对CD206与Legumain的共同标记证明了Legumain在DLBCL的肿瘤微环境中过表达，研究发现，因TAMs中Legumain过度表达，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要成分纤维蛋白和胶原蛋白Ⅰ分解代谢，进而起到重塑细胞外基质的作用。此外Legumain的过度表达还会刺激血管再生，新血管形成是肿瘤进展期间的关键过程，而Legumain抑制剂的使用则可以限制肿瘤的扩展，ECM的重建与血管再生。随着对Legumain作用机制的进一步研究，Legumain很有可能成为潜在预后指标，而给予Legumain抑制剂可能将成为一种优化DLBCL治疗、改善患者预后的潜在方法。

2.基质金属蛋白酶-9与可溶性白介素2受体：可溶性白细胞介素2受体(SIL-2R)是一种可溶性形式的IL-2R，较高的血清SIL-2R水平与某些形式的淋巴瘤的不良预后相关，例如成人T细胞白血病/淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)、外周血T细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤[7]。Umino等[8]对97例处于复发或难治阶段DLBCL患者的数据进行回顾性分析发现化疗后6个月内疾病进展的复发或难治阶段患者的SIL-2R(这个阶段的可溶性白细胞介素2受体简称“r/r SIL-2R”)的最佳临界值为861U/ml，高r/r SIL-2R组的生存率明显低于低r/r SIL-2R组，在多变量分析中，r/r sIL-2R与较低的1年无事件生存率(EFS)和总体生存率(OS)之间存在独立的显著相关性。

基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是MMP家族中的一员，具有裂解白介素2受体链的能力，它可以切断IL-2R的α链使得SIL-2R的浓度增加。已有研究发现肿瘤微环境细胞的基因表达谱，TAMs的表型存在基质金属蛋白酶(MMP)的过表达，DLBCL肿瘤组织中的MMP-9主要由TAMs产生并分泌[9]。MMP-9可以裂解许多细胞外基质(ECM)蛋白如Ⅰ型胶原纤维蛋白来调节ECM重塑，对肿瘤的侵袭、转移产生正面影响，最终导致患者对治疗的耐药或疾病复发[10]。SIL-2R是T淋巴细胞淋巴瘤/白血病的常用检测指标之一，该指标对于一些难治性或复发的DLBCL患者同样可以起到预测作用。MMP-9与SIL-2R之间的关系及其对细胞外基质的重塑可以为新一代的靶向药物提供方向，希望通过进一步研究能研发出干扰MMP-9合成与分泌的新药来改善患者的预后。

二、新血管增生

2.微血管密度：细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是多细胞有机体中细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖及氨基聚糖，通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖、分化。因此对肿瘤的发生、发展和转移起到重要作用[12]。根据细胞外基质基因表达谱的不同可将其分为1型与2型基质，前者主要反映了细胞基质沉积和组织细胞浸润，后者主要反映了微血管密度(microvessel density，MVD)和血管生成[13]。Shahini 等[14]观察到弥漫性大B细胞2型基质表达相对高的淋巴瘤与肿瘤血管密度增加和不良预后相关，并发现不论患者是接受伴有利妥昔单抗的标准治疗还是CHOP治疗，2型基质基因高表达的患者存在预后较差现象。吴金锟等[15]通过研究M2型巨噬细胞表达的CD68与微血管密度之间的关系发现CD68与微血管密度高表达呈正相关。TAMs可以通过提高VEGF水平促进血管内皮细胞生长，来增加肿瘤微环境的微血管密度，改善肿瘤组织的供血供氧情况，进而导致DLBCL肿瘤细胞的转移与浸润。

三、影响免疫微环境

1.程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1信号通路：程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，是B7受体家族的成员，是一种在T细胞表面表达的抑制性受体，与其同源受体PD-1结合后会转导抑制信号，从而抑制周围组织活化T细胞的增殖，抑制宿主抗肿瘤反应，进而为肿瘤创造一个免疫抑制的环境，最终导致肿瘤进展和患者预后不良。Kiyasu 等[16]通过对DLBCL活检样本进行PD-L1/PAX5双重免疫染色并研究发现PD-1和PD-L1阳性的患者与患者的生存率显著相关，多变量分析表明PD-1表达是OS的预后独立因素，PD-L1表达与DLBCL患者较差的临床预后相关(P=0.049)。此外，与PD-L1(-)DLBCL患者比较，PD-L1(+)DLBCL患者的总生存期较差。

通过对CD68与PD-L1进行标记，有研究者发现在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中，主要是TAMs在表达PD-L1，同时也有少量肿瘤细胞在表达PD-L1[17]。因此，PD-1/PD-L1途径也可能促进DLBCL肿瘤细胞的增殖，这也许是治疗DLBCL患者的一种新思路。TAMs与肿瘤细胞通过共同表达PD-L1，为肿瘤提供了免疫抑制的微环境，抑制免疫监视，促使瘤细胞的逃逸，影响患者预后。目前已有抗PD-1单抗靶向药物Nivolumab的问世，在复发/难治性经典霍奇金淋巴瘤的治疗中取得显著的临床疗效[2]。相信通过进一步研究及更多临床试验后，抗PD-1/PD-L1的药物也能应用到复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者身上，改善预后与生存状况。

2.人白细胞抗原-DR：人白细胞抗原(HLA)-DR是Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC)蛋白之一，与抗原递呈有关，可以帮助宿主免疫系统识别和攻击肿瘤细胞。因此，肿瘤细胞表面丧失HLA-DR的表达削弱宿主免疫系统对瘤细胞的识别与攻击，营造一个免疫抑制微环境，使这些肿瘤细胞可以存活。据报道，有研究者发现HLA-DR表达丧失与DLBCL患者的预后不良相关。Higashi 等[18]为了进一步评估HLA-DR表达缺失对DLBCL患者生存的影响，通过多变量回归分析发现HLA-DR表达的丧失是生存的独立预后因素。此外他们还通过HLA-DR在淋巴瘤中的免疫组织化学表达发现DLBCL中HLA-DR表达的丧失降低了肿瘤微环境中辅助T细胞的比例，这可能有助于肿瘤细胞逃避免疫监视。TAMs与HLA-DR之间是存在一定关系的，TAMs会下调MHC Ⅱ类表达，进而影响到HLA-DR的表达。以上研究表明TAMs可能通过下调MHC Ⅱ类蛋白的表达促使肿瘤细胞免疫逃逸，相反肿瘤细胞上HLA-DR的高表达会抑制巨噬细胞介导的肿瘤发展。故而可以推测通过免疫靶向TAMs可能有益于HLA-DR表达异常的患者。

3.白细胞介素-27/STAT3信号通路：白细胞介素27(interleukin-27，IL-27)是异二聚体细胞因子家族的成员，在促炎与抗炎相关的免疫应答中起到多重作用，尽管小鼠实验的诸多证据表明IL-27具有有效的抗肿瘤活性，但它就像一把双刃剑,增加IL-10的产生及程序性死亡配体1的表达、也有增强肿瘤生长转移的作用。Horlad 等[19]研究发现淋巴瘤病理组织中，IL-27通过STAT3激活诱导巨噬细胞上PD-L1的表达进而抑制机体免疫能力。因此，通过IL-27异二聚体肿瘤细胞及M2型巨噬细胞能够共同创造一个免疫抑制微环境，促进DLBCL的进展。尽管IL-27既有抗肿瘤作用又有促进肿瘤生长的作用，但这预示着IL-27在DLBCL中的作用机制尚需进一步研究，白细胞介素27/STAT3信号通路对DLBCL患者预后治疗研究也十分重要，可能是淋巴瘤患者免疫治疗的靶标。

四、其他影响方面

1. CAR T细胞治疗：专门针对CAR T细胞在治疗各种血液系统恶性肿瘤(尤其是B-NHL)方面显示出明显的功效。 Yan 等[20]研究发现，巨噬细胞的数量与极化状态有助于免疫抑制微环境的出现和T细胞反应的抑制。同时，巨噬细胞可能会产生不利的微环境，减轻CAR T细胞反应，因此，影响巨噬细胞的极化与数量可以改善B-NHL患者的CAR T细胞治疗的临床疗效，改善患者预后。肿瘤微环境的组成对CAR T细胞治疗的临床疗效密切相关。相信通过靶向TAM及其他免疫抑制因子并进行干预来调节肿瘤微环境可能具有使CAR T细胞治疗更持久、疗效更好的潜力。

2.绝对单核细胞计数及炎性细胞因子：即使在利妥昔单抗的时代，TAM表面高表达CD68或CD163的患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)也分别比CD68或CD163低表达的患者差。此外，Li 等[21]研究发现，TAM与外周绝对单核细胞计数之间呈正相关，由此推论单核细胞从外周血被募集到肿瘤微环境后分化成巨噬细胞，通过极化成为M2型巨噬细胞，从而导致疾病进展。单核细胞及其后代促进肿瘤生长和血管生成，并参与抑制宿主抗肿瘤免疫。越来越多的研究发现，在许多实体瘤中包括DLBCL，外周单核细胞升高是不利的预后因素。之前便有报道，接受标准R-CHOP治疗的DLBCL患者的外周绝对单核细胞计数在诊断时可预测患者的预后，首次复发时绝对单核细胞计数升高是复发性或难治性DLBCL患者生存的不良预后因素，而且标准R-CHOP治疗后随访期间进行的绝对单核细胞计数升高是预测DLBCL复发的危险因素。除了绝对单核细胞计数，有研究者发现细胞因子可以调节巨噬细胞向M2表型转化进而调节肠道炎症，还可通过测定外周血炎性细胞因子的浓度来预测DLBCL患者的生存。研究者通过筛选表达与DLBCL患者存活率相关的炎性基因，以此建立了独立于IPI评分的预测模型。因此，即使在IPI低评分组也可以识别出高危人群的5年生存率。

3.miR-155：miR-155是一种microRNA，是致癌开始时诱导M1巨噬细胞，募集炎性细胞和抗肿瘤反应所必需的，通常在B细胞淋巴增生性疾病中过表达。EB病毒感染是第一个检测到microRNA表达的病毒，EB病毒感染也可能有助于改变B细胞淋巴瘤中的microRNA水平[2]。EB病毒通过诱导感染的B细胞分泌免疫抑制细胞因子如IL-10和TGF-β，直接影响巨噬细胞向M2型极化。研究者在研究中对50岁以上且无免疫抑制的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中的巨噬细胞浸润和miR-155表达进行比较，发现未感染EB病毒的DLBCL中，miR-155的过表达与M2型巨噬细胞极化降低有关，在感染EB病毒的DLBCL中情况则相反。Zonari 报道巨噬细胞中miR-155的不足会导致M1型巨噬细胞极化受损，而分化为M2型巨噬细胞。通过以上研究可以知晓，调节miR-155的表达或预防和重新编程免疫调节和巨噬细胞极化的治疗策略可以辅助标准治疗，这可能是治疗EBV+DLBCL的新方法。

4.细胞外囊泡：几乎所有细胞都分泌细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，它们包含蛋白质、脂质和核酸，充当细胞间通信和分子转移的介质。 在肿瘤中，EVs来自癌细胞，免疫细胞以及其他非免疫宿主细胞，是肿瘤微环境的关键组成部分。不同来源的EVs在肿瘤免疫中起着不同的作用，影响着肿瘤的增殖、转移及其对治疗的耐药性。研究发现，DLBCL衍生的EVs可以通过增加PGC-1β蛋白的表达来调节氧化代谢，促进抗炎活化的巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化来调节肿瘤微环境，从而加速肿瘤的进展。可想而知，早期对PGC-1β蛋白进行检测对筛选出预后不良的DLBCL患者是有帮助的。而且针对细胞外囊泡或PGC-1β进行靶向治疗也许是将成为治疗DLBCL的新思路。

五、展 望

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤，是一种高度异质且有侵袭性疾病。当前的标准疗法是R-CHOP治疗，尽管在利妥昔单抗的时代，DLBCL逐渐成为一种可治愈性疾病，但仍有部分患者存在复发、耐药的情况，导致最终预后不良。研究者通过基因检测发现DLBCL患者的生存不仅与肿瘤本身相关，与肿瘤微环境同样密不可分。巨噬细胞是微环境中重要的免疫细胞，通过表达Legumain蛋白、分泌MMP-9并影响SIL-2R浓度重塑细胞外基质；通过分泌高水平血管内皮生长因子影响微血管密度并促进血管再生、通过PD-1/PD-L1信号通路与HLA-DR影响免疫微环境、协助免疫逃逸等方面影响着DLBCL的发生、发展、转移及患者的预后。

综上所述，通过了解TAMs与DLBCL患者预后之间的联系及对相关机制的研究，可以为判断患者的预后及治疗找到新思路新方法，探索更便捷更有指向性的预后指标和新的治疗靶点，为临床试验提供坚实理论基础。希望可以通过不断发现的新机制以及对TAMs的表型研究、精准标记TAMs方面做深入研究，不但能协助早期识别易复发或难治的患者并提供针对性治疗，还能研发新靶向药物，为DLBCL患者带来福音。