中枢性PNET患者基因表达谱变化及生物信息学分析

汪 颖 李 朋 王 博 刘丕楠

原始神经外胚层肿瘤(primitive neurotodermal tumor，PNET)为一种罕见的高度恶性的神经系统肿瘤，由Hart等[1]于1973年首次报道，分为中枢性和外周性两大类[2]。其中中枢性PNET多发于儿童，肿瘤呈浸润性增长，且侵袭性强、恶性程度高、预后差[3]。现阶段中枢性PNET治疗以手术切除加辅助放化疗为主，总体疗效较差，且发病原因不明[4]。

生物学中的基因芯片技术可用于肿瘤分子相关途径的分类、鉴定和预测，并可识别与临床相关的肿瘤分子标志物及潜在治疗靶点，从而可对疾病的临床诊断及治疗起提示作用[5，6]。

本研究通过对GEO数据库中下载的中枢性PNET肿瘤组织基因芯片数据集GSE74195进行综合生物信息学分析，探讨基因表达改变后，中枢性PNET分子生物学功能的改变及影响该过程的关键蛋白，以期进一步探讨中枢PNET疾病发生、发展相关分子机制，为中枢PNET的临床治疗提供新思路。

材料与方法

1.材料：登录美国基因表达汇编(Gene Expression Omnibus, GEO)数据库，检索PNET研究相关的基因表达芯片数据，获取芯片分析平台为GPL570 (HG-U133-Plus-2) Affymetrix 表达谱芯片数据集GSE74195。GSE74195包含5例中枢PNET肿瘤标本和5例正常小脑组织对照标本。该研究中所获得的肿瘤标本为术后立即至于液氮中，并一直在-80℃保存直至使用，正常组织标本获得于没有脑肿瘤疾病史的患者。

2.差异表达基因筛选:使用在线分析工具GEO2R(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/geo2r/)对数据集GSE74195进行处理，以条件FC>3且P<0.01进行差异基因筛选，获得PNET肿瘤组织中显著高表达的差异基因列表。

3.GO富集分析和KEGG通路分析:将上述所获得的显著差异表达基因列表导入在线生物信息数据库WebGestalt，进行GO功能分析及KEGG通路分析，以FDR<0.05为筛选条件。

4.可能作用药物筛选:将上述所获得的显著差异表达基因列表导入使用在线生物信息数据库WebGestalt进行作用药物筛选，以FDR<0.05为筛选条件。

5.蛋白质的相互作用网络建设:使用String在线分析网站(https://string-db.org/，version 11.0)对上述获得的显著差异基因列表进行分析，设置可信度0.7(confidence：0.7)为差异有统计学意义，选择实验或数据库支持进行筛选条件限制，分析得到相关蛋白质的相互作用网络图，根据差异基因与其相互作用蛋白的连线数量进一步确定蛋白质相互作用网络中的关键蛋白。

结 果

1.显著高表达差异基因的获得:依据FC >3且P<0.01的筛选条件对所获得的差异表达基因进行筛选，结果获得340个相对于小脑正常组织，中枢性PNET肿瘤组织中显著高表达的差异基因。差异基因表达谱宏观表象见图1。

图1 差异基因火山图

2.差异基因功能通路富集分析：将上述筛选获得的340个显著上调的差异基因映射到GO数据库。GO生物过程分析发现差异基因主要富集在细胞有丝分裂、细胞周期及细胞增殖等生物学过程；分子功能包括二磷酸多糖蛋白糖转移酶活性、低聚糖基转移酶活性、rRNA结合、细胞外基质结构成分、核糖体的结构成分等的功能；细胞组成分析显示这些差异基因集中在低聚糖基转移酶复合物、浓缩染色体着丝粒区及染色体区。GO分析结果见表1。KEGG通路分析显示，差异基因富集的信号通路有细胞周期和ECM受体相互作用等，详见图2。

3.可能作用药物筛选：将显著高表达的差异基因输入WebGestalt在线数据库，对可能有效的药物进行筛选，以FDR<0.05为筛选条件。数据库选择GLAD4U时，按富集程度差异，获得前10个对PNET可能有效的药物候选，分别为紫杉烷类(taxanes)、紫杉醇(paclitaxel)、胃蛋白酶(pepsin)、奈替米星(netilmicin)、顺铂(cisplatin)、铂化合物(platinum compounds)、放线菌素类(actinomycines)、达克汀霉素(dactinomycin)、抗肿瘤药(antineoplastic agents)及蛋白激酶抑制剂(protein kinase inhibitor)，结果如图3所示。数据库选择DrugBank时，青蒿醇(artenimol)为唯一候选药物(富集比例5.5749)。

4.蛋白质-蛋白质相互作用网络构建:蛋白质与蛋白质之间相互作用网络的构建，可进一步明确各差异表达基因或蛋白之间的相互作用关系。基于此，本研究将上述获得的340个显著上调的差异表达基因上传到String在线工具，经分析获得差异蛋白互作网络图，其中包括305个圆点(代表差异基因或蛋白)，938条线(代表相互作用关系)。根据差异基因与其相互作用蛋白的连线数量，确定了5个关键蛋白分子。

讨 论

临床研究表明肿瘤的遗传学特征可影响其生物学行为、治疗及预后，这些研究从分子层面揭示了肿瘤发生、发展的可能原因，从而为临床诊断及治疗奠定基础[7]。而现阶段中枢性PNET病因不明且发病率低，临床治疗难度大[8]。为此，本研究通过生物信息学技术挖掘相关数据，以期获得中枢性PNET肿瘤潜在治疗靶点，为进一步实验研究提供理论支持。

本研究共分析获得340个显著高表达基因，通过对这些差异基因进行GO分析及KEGG通路筛选，发现上调基因主要参与细胞周期过程，利用数据库筛选可能有效的药物，发现除作用于细胞周期的紫杉烷类、铂化合物及常见抗肿瘤药外，分析结果提示青蒿醇也可能对中枢性PNET肿瘤有一定效果，而此前未见有报道，可能对今后中枢性PNET肿瘤的治疗有一定提示作用。

表1 PNET高表达差异基因GO富集分析结果

图2 差异表达基因通路分析

图3 差异基因可能有效药物筛选

图4 差异表达基因/蛋白互作网络图

进一步构建的蛋白互作网络图中，本研究获取了5个关键蛋白分子，分别是泛素核糖体融合蛋白52(UBA52，连线43)、泛素C(UBC，连线35)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1，连线31)、着丝粒蛋白K(CENPK，连线29)、神经发育蛋白1(NDE1，连线19)。这些蛋白可能在中枢性PNET肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。蛋白互作网络图见图4。

研究表明，肿瘤是一种细胞周期性疾病，恶性肿瘤的发生、发展与细胞周期调节机制的紊乱有密切联系[9]。而笔者获取的5个关键蛋白，都参与了细胞周期的调控过程，其中CENPK蛋白由269个氨基酸组成，编码基因位于染色体5q12.3上，是着丝粒蛋白家族成员之一。而报道显示，着丝粒调节失调或功能紊乱可促进肿瘤的发生[10]。CENPK主要定位于着丝粒的内层，可对CENPA与其他着丝粒组分的有效组装进行调控，且在卵巢癌、肝癌等高表达，并与预后相关，可能扮演着致癌基因的角色[11～13]。提示CENPK在调控着丝粒的组装和功能方面起重要作用，进而影响肿瘤的发生、发展。但目前关于CENPK的研究较少，调控机制尚不清楚。靶向调控PNET中CENPK的表达可能为PNET治疗提供新的策略，但需进一步扩大样本量进一步验证CENPK在中枢性PNET组织中的表达，在蛋白水平上探讨其与中枢性PNET临床病理特征及预后的关系。

此外，UBA52 是由泛素和核糖体蛋白 L40 组成的融合蛋白，在体内可以被泛素羧基端水解酶快速精准的剪切为泛素分子和核糖体蛋白 L40。泛素可形成多聚泛素化链对底物修饰，进一步通过泛素蛋白酶体途径特异性降解细胞周期相关蛋白，从而阻滞细胞周期。

细胞周期蛋白依赖性激酶1 (cyclin-dependent kinases 1，CDK1)为由CDC2基因编码，相对分子质量为3.4×104的蛋白质，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一。CDK1可与cyclinB组成复合物，可促使细胞周期从G2期进入M期，从而影响细胞有丝分裂过程[14]。NDE1蛋白位于中心体，作为调节动力蛋白功能的多蛋白复合物的一部分与其他中心体成分相互作用[15]。文献报道显示该蛋白对大脑皮质发育至关重要，在脑增殖室区皮质神经元祖细胞分裂过程中，可通过控制有丝分裂纺锤体的方向来调节神经元的产生。由此可见，这几个差异蛋白主要集中在细胞周期及有丝分裂过程，与中枢性PNET发生、发展有密切关系，而这种机制是否参与了PNET的发病尚待进一步的研究。

本研究采用生物信息学研究方法筛选出中枢性PNET肿瘤组织相关的差异表达基因，并对其进行了功能预测，为寻找与中枢性PNET发生、发展及治疗相关靶点的研究提供了新思路。