电针调节2型糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β及胰岛素抵抗的机制研究*

金奉奎，李 瑞△，曹昺焱，宋姗姗，张婧怡，金永祚

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

2型糖尿病是以高血糖和脂肪代谢紊乱为特征的慢性代谢性疾病。是以全身代谢紊乱以及干预心血管、神经、眼，肾脏等重要器官的多种并发症为其主要临床表现的一种疾病。其发病机制尚未阐明，病因可能是多源性的。糖尿病的发病率高，据统计，中国有1.14亿糖尿病患者[1]。新近临床流行病学研究显示[2]，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的发病率较高，占全部糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患者的90%。2型糖尿病与人口老龄化、生活水平改善等社会变化所致肥胖人群的增加有关。该病除了严重危害患者健康外，还给中国政府和患者带来严重经济负担。有研究显示[3]，2型糖尿病及其并发症的治疗给中国造成了巨大的经济负担，直接医疗总费用占卫生总费用的3.94%，其中并发症的治疗成本占总直接医疗支出的81%。

胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是2型糖尿病形成的关键[4]。胰岛素抵抗是正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，也即胰岛素生物作用的贬值。表现为外周组织对胰岛素的敏感性下降，影响葡萄糖的利用障碍。现代研究表明[5]，胰岛素抵抗主要由遗传及环境因素共同引起，与肥胖、慢性高血糖、高血脂、炎症标志物及细胞因子等多种因素有关。其中炎性因子与胰岛素抵抗有密切相关性。有研究者[6]应用炎症评分发现2型糖尿病患者的炎性因子水平均增加，一些炎性因子参与了胰岛素抵抗的发展。本实验通过对2型糖尿病大鼠电针干预实验，观察其血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、空腹血糖和胰岛素抵抗指数水平变化，为临床研究治疗该病提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为7只体质量140～160 g(2月龄)的SPF级雄性Zucker Lean[ZL(fa/+)]大鼠以及14只同月龄SPF级雄性Zucker Diabetic Fatty[ZDF(fa/fa)]大鼠[北京维通利华公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006]。动物于23 ℃、空气流通、相对湿度60%、12 h昼夜循环光照的条件下饲养。实验于1周诱导饲养后开始进行，适应性饲养期间，如无特殊需要，动物自由饮食水，喂食普通饲料。

1.2 动物分组及模型制备

全部大鼠适应性饲养1周后，按ZDF大鼠说明书要求，以Purina#5008饲料喂养4周，诱导ZDF大鼠高血糖症状；其后以空腹血糖及OGTT2h血糖均>11.1 mmol/L为成模标准。成模的ZDF大鼠依空腹血糖排序随机区组分为：模型组7只、电针组7只，雄性ZL大鼠作为空白组7只，分别进行相应干预。干预期间，全部动物均以Purina#5008饲料喂养(组成：粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纤维≤4.0%，粗灰分≤10%，水分≤11.0%，磷≥0.65%，钙0.75%～1.25%；原料组成：玉米粉，脱壳大豆粉，小麦粉，鱼粉，麦麸，啤酒酵母，蔗糖蜜，麦芽，甜菜粉，燕麦粉，大豆粉，脱水苜蓿草粉，大豆壳粉，矿物质和维生素)。

1.3 实验耗材

罗氏ACCU-CHEK血糖仪(LOT 1012977，罗氏血糖健康医护公司);罗氏血糖试纸(LOT 2468543，罗氏血糖健康医护公司);中研太和牌针灸针0.13 mm×7 mm(21216112，北京中研太和医疗器械有限公司);电针仪器;1.5 mL及5 mL注射器等。

1.4 干预方法

1.4.1 空白组及模型组 不干预。

1.4.2 电针组 将动物固定于可伸出四肢的棉布鼠套静置5 min，以0.13 mm×7 mm针灸针针刺双侧“足三里”“三阴交”“脾俞”“胃脘下俞”，进针得气后行平补平泻手法，并连通电针仪(电针一端连接于“胃脘下俞”，一端连接同侧“足三里”，形成回路)，连续波，频率15 Hz，电流输出强度2 mA，留针25 min，每周6次(周一至周六)，4周。以上各种干预操作均于每日13：00—18：00期间进行，连续干预4周。于干预第1、第4周周六晚20：00禁食，周日早8：00检测空腹血糖。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 空腹血糖、TNF-α、IL-6、ZL-1β及血清胰岛素抵抗指数 所有动物于全部干预结束后，自由饮食水，当晚22：00禁食，次日早8：00以2%戊巴比妥钠溶液按照45 mg/kg的药量比腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5～10 mL离心管中，室温静置凝固后，于4℃条件下3 000 r/min离心15 min分离血清。以放射免疫法测血清血糖、TNF-α、IL-6 、IL-1β及血清胰岛素抵抗指数。

胰岛素抵抗指数：HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

1.5.2 IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白 所有模型大鼠于全部干预结束后，自由饮食水，当晚22：00禁食，次日早8：00以2%戊巴比妥钠溶液按照45 mg/kg的药量比腹腔注射麻醉，依据第4周干预后空腹血糖数据，每组随机抽取，每样本取材骨骼肌，取材样本在-80℃急速冷冻保存，以蛋白印迹法测骨骼肌IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表达。

1.6 统计学方法

运用SPSS20.0统计学分析软件进行统计学处理。数据采用均值±标准差表示，两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义,P<0.01认为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比较

经干预后，电针组、模型组与空白组相比，电针组大鼠血清TNF-α水平明显较高(P<0.05)；而电针组模型组相比血清TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.05)。电针组、模型组与空白组相比，血清IL-6水平明显较高(P<0.05)；而电针组与模型组相比，血清IL-6水平差异有统计学意义(P<0.05)。电针组、模型组与空白组相比，血清IL-1β水平明显较高(P<0.05)；而电针组与模型组相比血清IL-1β差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比较

2.2 各组大鼠空腹血糖(FBG)水平比较

造模前电针组、模型组与空白组比较，空腹血糖明显上升(P<0.05)，而电针组和模型组两组相比,差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。干预第4周后，电针组、模型组与空白组相比，空腹血糖值升高(P<0.05)；电针组与模型组相比，血糖有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，比较均值评分显示电针组有一定降糖效果。同组干预前后比较，模型组空腹血糖明显升高(P<0.05);电针组血糖变化不显著(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠干预前后空腹血糖(FBG)比较

2.3 各组大鼠胰岛素抵抗指数水平比较

经干预后，电针组、模型组与空白组相比，大鼠胰岛素抵抗指数水平明显升高(P<0.05)；而电针组与模型组相比，血清胰岛素抵抗指数水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠胰岛素抵抗指数水平比较

2.4 各组大鼠IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表达情况

电针组与空白组比较，大鼠骨骼肌IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表达有所提高，但差异无统计学意义(P>0.05);电针组与模型组比较，大鼠骨骼肌IRS-1 Ser307蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而GLUT4蛋白表达明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图1。

图1 各组大鼠IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表达

表4 各组大鼠IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表达比较

3 讨论

2型糖尿病属中医学中的“消渴”“消瘅”范畴，中医认为糖尿病的病因为禀赋不足、情志失调、饮食不节和劳欲过度等引发肺、脾、肾功能失调导致消渴，病机为燥热偏盛、阴津亏损,多以阴虚为本、燥热为标。因此清热润燥、养阴生津为治疗与选穴原则。选取足三里、三阴交滋阴补肾、益气生津、健脾益胃清热外，结合电针刺激作用达到活血化瘀、清热解毒功效，起到机体免疫功能调控[7-9]。选用背俞穴脾俞、胃脘下俞，《素问》云：“治脏者治其俞”，脾俞、胃脘下俞可发挥调畅脏腑经气、整体津液代谢调节、恢复阴阳平衡的功能。而且背俞穴深层为分布于脊柱两侧的交感神经带，具有调节对应内脏功能作用[10]。

胰岛素通路途径是首先胰岛β细胞分泌胰岛素，胰岛素血液运输到靶细胞，激活细胞内的胰岛素受体底物IRS，IRS-1酪氨酸磷酸化激活PI3K，激活后的PI3K可以催三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，其作为第二信使激活AKT，激活开启PI3K-Akt-GLUT4，细胞表面激活GLUT4数量增多，增强葡萄糖的摄取能力，达到降血糖。其中，IRS-1的酪氨酸磷酸化位点(RIS-895)和丝/苏氨酸磷酸化位点(IRS-307)之间存在竞争关系，两者处于此消彼长的趋势。炎性细胞因子促进丝/苏氨酸磷酸化会竞争性地抑制酪氨酸磷酸化[11]，从而下调下游PI3K-Akt-GLUT4通路活性，减少骨骼肌在胰岛素刺激下对葡萄糖的摄取，从宏观上即表现为胰岛素抵抗，说明炎性因子是导致胰岛素抵抗的一个重要因素，其机理涉及炎性因子对IRS-1酪氨酸磷酸化的抑制作用。而炎性因子与2型糖尿病大血管并发症有密切关系[12-13]，即胰岛素抵抗后炎性因子在血循环中的浓度升高，作用于肝脏导致CRP合成增加[14]，CRP水平与2型糖尿病大血管病变发生正相关[15-16]。

本实验结果显示，造模前后电针组、模型组与空白组相比，血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β和空腹血糖水平出现明显升高趋势，干预结束后，电针组与模型组相比，电针可有效降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，差异有统计学意义(P<0.05)，干预后电针组与模型组比较，电针组的骨骼肌IRS-1 Ser307明显下降(P<0.05)而GLUT4蛋白表达明显增高(P<0.05)，干预后电针组比模型组的空腹血糖(FBG)水平有所下降，干预结束后与模型组相比，电针组胰岛素抵抗指数水平明显下降(P<0.05)。提示2型糖尿病大鼠炎性因子可能与胰岛素抵抗密切相关。

综上所述，电针可降低2型糖尿病大鼠炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平，调节 IRS-1 Ser307、GLUT4表达，其可部分解释电针对IR以及2型糖尿病的作用机制及作用途径。同时电针可降低空腹血糖(FBG)及胰岛素抵抗指数水平，说明电针可控制2型糖尿病模型大鼠炎性因子水平，从而改善其胰岛素抵抗状况及降低2型糖尿病的大血管病变,通过本实验证明电针起效的作用可能与其相关。