电针对骨骼肌萎缩模型大鼠的干预效果及作用机制研究

刘祥华,罗湘筠,李文倩

(湖南中医药高等专科学校附属第一医院 湖南省直中医医院，湖南 株洲 412000)

骨骼肌萎缩患者主要的临床表现是肌纤维发生进行性缩小或者消失，患者肌肉质量、容积缩小，其骨骼肌运动以及内分泌功能发生受损。临床发现，骨骼肌萎缩主要包括失神经性肌萎缩、衰老性肌萎缩和药源性肌萎缩等，引起患者肢体运动功能障碍，对正常生活产生严重影响[1]。目前骨骼肌萎缩的原因较为复杂，其发病机制尚不明确，通过研究其发生机制，能控制患者骨骼肌萎缩[2]。电针可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩，已经有大量的研究证实，其能改善周围神经损伤的症状，促进神经损伤修复，对靶器官骨骼肌有延缓萎缩作用[3]，目前临床中关于电针治疗骨骼肌萎缩作用机制尚不明确。本研究旨在研究电针对骨骼肌萎缩模型大鼠的干预效果及作用机制，为临床治疗骨骼肌萎缩提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究动物 选取健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠30只(由重庆医科大学动物实验中心提供，医学动物合格证号：SCXK渝2012-0002)，体质量190～220 g，鼠龄8～10周。本研究符合我院研究伦理委员会标准。

1.1.2 主要试剂 Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR一抗(美国CST公司提供)；PBS缓冲液(波尔实验室提供)；MURF1、PGC-1α、FNDC5 ELISA试剂盒(美国Bio-Rad公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌萎缩模型建立 30只大鼠随机分为模型组、假手术组和电针组，各10只。参考高睿琦[4]文献，所有大鼠给予10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，在无菌手术台上进行建模。具体操作：固定，将麻醉后的大鼠固定在干净的手术台中；备皮，将大鼠右后肢充分暴露后，做好消毒的准备工作；将手术器械高温消毒后，沿大鼠大肌间隙进行钝性分离，坐骨神经暴露；神经缺口建立，将坐骨神经剥离，使用手术剪将电针组和模型组两组大鼠坐骨神经中段切断后，将两段进行游离段反折，制作2.0 mm的神经缺口，假手术组大鼠只需要将坐骨神经暴露，不需要将坐骨神经切断。

1.2.2 电针干预 大鼠建模2 d后，早9:00将电针组大鼠在柔软型固定器上进行固定，进针采用毫针，取穴参照《大鼠穴位图谱的研制》和《实验电针学》进行：侧足三里、承山。进针5～7 mm后，将侧足三里、承山两穴与电针仪连接，电针参数设置：采用连续波，频率为5 Hz，强度1.5 mA。1次/d，每次维持10 min，需要连续干预3周。假手术组和模型组大鼠每天进行固定，时间与电针组保持一致。

1.2.3 腓肠肌湿重、干重测定 大鼠建模成功后，采用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)对大鼠进行麻醉，将大鼠腓肠肌快速分离，采用电子天平进行称重，主要包括湿重、干重、干重/体重比值。

1.2.4 骨骼肌肌纤维直径、面积测定 HE染色：快速提取大鼠骨骼肌，使用40 mL/L的多聚甲醛进行固定，常温下使用15%的EDTA脱钙6周，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，HE染色，观察。骨骼肌经过HE染色后，采用LeicaQwin图像分析系统，分析骨骼肌肌纤维直径、面积，标本做4个切面，选择4个髙倍镜视野，观察骨骼肌肌纤维直径、面积，记录实验数据。

1.2.5 骨骼肌相关蛋白检测 采用ELISA检测，将采集到的标本，取50 mM碳酸盐(pH9.5, 0.05 mol/L CB)适当稀释的抗MURF1、PGC-1α、FNDC5 0.1 mL，添加至聚苯乙烯反应板孔中，加盖后温度4 ℃ 24 h，次日使用洗涤剂洗涤3次后，甩干。在各孔中加入稀释液(pH7.4, 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释的待测标本0.1 mL，同时加入阳性和阴性的对照标本，在43 ℃置60 min，将液体移除洗涤3次后，甩干。在各孔中加入MURF1、PGC-1α、FNDC5的酶标抗体0.1 mL，43 ℃置60 min。液体移去后洗涤3次，甩干。在各个孔中加入底物液四甲基联苯胺(TMS)，空白孔不加,0.05 mol/L枸橼酸(10.5 g/L)4.86 mL混匀,加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中,临用时加30% H2O24.0 μL,混匀]0.1 mL，置黑20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 mL，终止反应。在酶标仪上读取A405吸收值。分析MURF1、PGC-1α、FNDC5蛋白表达。

1.2.6 Akt/mTOR通路相关蛋白检测 采用Western Blot检测，将采集到的标本10 000×g离心处理10 min，取出上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白定量，将50 μg蛋白加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中，100 ℃加热处理5 min促使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中4 ℃下封闭1 h，封闭结束后，加一抗(Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR)使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min，加二抗使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(1∶10 000)，室温摇动孵育1 h，最后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min。采用DAB染色试剂盒显色，光密度扫描后进行定量分析。以GAPDH为内参。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 电针对骨骼肌萎缩模型大鼠腓肠肌湿重、干重的影响

如表1所示，电针组骨前肌湿重、干重、干重/体重高于模型组，低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组骨前肌湿重、干重、干重/体重低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠腓肠肌湿重、干重比较

2.2 电针对骨骼肌萎缩模型大鼠骨骼肌肌纤维直径、面积的影响

如表2所示，电针组骨骼肌肌纤维直径、面积高于模型组，低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组骨骼肌肌纤维直径、面积低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠骨骼肌肌纤维直径、面积比较

如图1所示，假手术组大鼠骨骼肌肌纤维分布均匀，排列整齐，纤维之间的间隙保持一致，细胞核主要在肌细胞周围散布。模型组大鼠骨骼肌肌纤维结构不规则，排列混乱，肌纤维发生萎缩，纤维之间的间隙增大,细胞核大小不一致，分布不规律。电针组大鼠骨骼肌肌纤维萎缩程度低于模型组，细胞核增加呈聚集分布。

图1 3组大鼠骨骼肌病理学观察(HE染色，200×)

2.3 电针对骨骼肌萎缩模型大鼠骨骼肌相关蛋白的影响

如表3所示，电针组骨骼肌相关蛋白MURF1表达低于模型组，PGC-1α、FNDC5表达高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。电针组骨骼肌相关蛋白MURF1表达高于假手术组，PGC-1α、FNDC5表达低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组骨骼肌相关蛋白MURF1表达高于假手术组，PGC-1α、FNDC5表达低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠骨骼肌相关蛋白表达比较

2.4 电针对骨骼肌萎缩模型大鼠Akt/mTOR通路的影响

如表4所示，电针组Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR表达高于假手术组和模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR表达低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 3组大鼠Akt/mTOR通路相关蛋白(WB图)

表4 各组大鼠Akt/mTOR通路相关蛋白比较

3 讨论

骨骼肌萎缩发生的主要原因是因为机体中肌蛋白合成显著减少，分解过多，许寿生[5]研究指出，骨骼肌萎缩中蛋白质的分解速度显著大于其合成速度。本研究建立骨骼肌萎缩模型，采用电针进行干预，通过调控Akt/mTOR通路，研究其对骨骼肌萎缩作用机制，为临床治疗骨骼肌萎缩提供理论支持。

本研究结果显示，电针组骨前肌湿重、干重、干重/体重高于模型组，低于假手术组，说明通过电针治疗后，能改善大鼠骨前肌湿重、干重以及干重/体重。肌肉重新获得神经支配，肌肉萎缩速度变快，导致靶肌肉发生了不可逆的萎缩，肌细胞发生纤维化，其神经不能进行再支配[6-7]。电针组骨骼肌肌纤维直径、面积高于模型组，低于假手术组，说明电针能延缓大鼠骨骼肌萎缩的程度，促进其恢复。相关研究指出，电针对增龄性骨骼肌萎缩模型大鼠进行干预，大鼠腓肠肌湿重/体重增加，肌纤维平均横截面积也随之增加[8-9]。苏艳红等[10]研究也指出，采用后肢悬垂法建立骨骼肌萎缩模型，对其腓肠肌上端末梢进行针刺，发现大鼠比目鱼肌湿重/体重比值增加，其横截面积扩大。

骨骼肌是机体中重要的运动器官，也是重要的内分泌器官，机体中多种活性多肽以及细胞因子均通过骨骼肌分泌和合成，对骨骼肌糖、脂肪、蛋白质代谢发挥调控作用[11-12]。MuRF1属于一种泛素蛋白连接酶，在骨骼肌和心肌中表达，泛素蛋白酶有多个调节点，影响因素较多，在骨骼肌萎缩过程中发挥着重要作用[13]。在骨骼肌萎缩模型研究中，MuRF1 mRNA表达水平较高，在代谢发生之前，是诊断早期骨骼肌萎缩的重要指标[14]。本研究显示，模型组大鼠MuRF1蛋白表达较高，本研究与其保持一致。MuRF1具有泛素连接酶活性作用，其表达上调会导致粗丝连接蛋白发生断裂甚至水解，通过降解肌纤维蛋白，导致骨骼肌萎缩，发生病变[15]。本研究结果显示，电针组骨骼肌相关蛋白MURF1表达低于模型组，说明电针干预能下调MURF1表达。FNDC5属于一种肽类激素蛋白主要通过肌肉分泌。PGC-1α属于一种过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子，FNDC5是其主要的依赖性肌肉因子[16]。PGC-1α参与线粒体生成、能量代谢以及肌纤维类型转化过程。相关研究指出，PGC-1α对骨骼肌中的FNDC5有促进作用，通过外部的应激刺激对骨骼肌中的PGC-1α、FNDC5表达有诱导作用，通过断裂能促进肌肉因子Irisin形成[17-18]。本研究显示，电针组PGC-1α、FNDC5表达高于模型组，说明电针能上调PGC-1α、FNDC5表达，从而调控大鼠骨骼肌萎缩情况。

mTOR属于雷帕霉素靶蛋白，Akt可以直接作用于mTOR，因此mTOR是Akt下游的一种底物，发挥着重要作用。研究指出，mTOR是Akt下游的重要靶点，可以被磷酸化Akt激活，调控肌卫星细胞生长主要是通过下游靶物来完成，促进其增殖，有助于相关蛋白质合成，起到延缓骨骼肌萎缩的作用[19-20]。本研究结果证实，电针组Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR表达升高，说明电针能将Akt/mTOR信号通路激活。通过本研究进行分析，电针能有效控制失神经性骨骼肌萎缩的速度，通过调控Akt/mTOR通路相关蛋白表达，促进肌蛋白分解和合成，抑制肌细胞凋亡，促进肌卫星细胞增殖分化，参与神经肌接头传导，促进其肌细胞能量代谢转换,因此电针可治疗骨骼肌萎缩。

综上所述，电针对骨骼肌萎缩模型大鼠干预效果显著，能改善大鼠骨骼肌萎缩状况，通过激活Akt/mTOR通路，调控骨骼肌相关蛋白MURF1、PGC-1α和FNDC5表达，从而抑制骨骼肌萎缩。